二化螟γ-氨基丁酸（GABA）受体的克隆和表达研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

二化螟（chilo suppressalis（walker））属鳞翅目螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，且分布广、危害重。特别是近年来，由于我国水稻种植结构和水稻种植品种的改变，双季稻面积缩小，单季稻面积扩大，形成单、双季稻，早、中、迟熟品种混栽的局面，以及随着水稻种子市场的放开， 大田种植品种增多，利于二化螟发生的杂交稻、籼稻占优势等因素， 给二化螟提供了多层次的营养条件，使其随时都有适宜的寄主植物，以致经常性暴发危害。盛承发等（2003）统计报道，二化螟暴发造成的经济损失多达115亿元。目前对于二化螟的控制主要是以化学防治为主，然而由于自20 世纪80 年代以来，连续、单一大量使用杀虫单、三唑磷、甲胺磷等农药防治二化螟， 使我国水稻主产区的二化螟已明显产生抗药性，防治效果下降，用药量成倍增加，残虫量上升，为害逐年严重。陆玉荣等(2003)对扬州地区二化螟监测结果表明，在i 997 ~2000年这4年中，二化螟对杀虫单抗性逐年上升，抗性水平增大了11.5倍，至2000年抗性己达110.9倍；吕亮等于2005～2007 年连续对湖北省4 个稻区的二化螟进行了室内毒力测定， 结果表明， 监测地区水稻二化螟对三唑磷及阿维菌素均产生了明显的抗药性。而且由于氟虫腈、杀虫单、对硫磷等高效杀虫剂的抗药性问题和其对非靶标生物（如鱼类和蜜蜂等）安全性的影响，都已相继在我国被禁用于水稻害虫的防治，使得防治二化螟药剂品种单一的现状难以缓解。

目前，在农业生产中用于二化螟防治的药剂主要有作用于昆虫鱼尼丁受体（ryanodine receptors , ryrs）的氯虫苯甲酞胺类杀虫剂和作用于昆虫γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, gaba）受体的阿维菌素类杀虫剂等。近几年来，一些最新研发的化合物，如异噁唑啉类化合物（fluralaner）及其类似物、双酰胺类化合物（mda-7和bpb）及其类似物、银杏内酯（ginkgolides和bilobalide）、三环二腈化合物（kn244）、双环硫化磷酸酯类化合物（ibipps）、联苯肼酯化合物（bifenazate）等均通过作用于gaba受体而表现出良好的选择性杀虫活性。其中异噁唑啉类和双酰胺类化合物还表现出与目前抗性昆虫无交互抗性，且对哺乳动物低毒，可望开发出新的二化螟防治药剂，从而缓解防治二化螟药剂品种单一的现状，并可降低二化螟对阿维菌素等杀虫剂产生抗药性的风险。因此，本课题通过rt-pcr技术克隆获得二化螟gaba受体rdl（resistant to dieldrin，抗狄氏剂）亚基，对于进一步研究其组成的受体对新型化合物的反应提供了重要的基础依据。

参考文献：

2. 研究的基本内容和问题

本实验研究目标：在实验室建立稳定的二化螟人工继代饲养方法，通过rt-pcr技术、race技术等克隆获得二化螟gaba受体rdl亚基，并对其进行系统发育分析和生物信息学分析。

本实验研究内容：

（1）二化螟的室内饲养；

3. 研究的方法与方案

见附件

4. 研究创新点

本实验通过通过分析果蝇（Drosophila melanogaster, GeneBank：AAA28559.1）、家蝇（Musca domestica, GeneBank：Q75NA5.2）、人类（Homo sapiens, GeneBank：AAH22449.1, AAB29370.1, AAH10641.1）、褐家鼠（Rattus norvegicus, GeneBank：1506343B）、牛（Bos taurus, GeneBank：CAA29190.1）等其他物种的GABA受体基因的保守序列设计简并引物，利用巢式PCR技术获得一条不同于已公布的二化螟转录组数据库（http://ento.njau.edu.cn/ChiloDB/）中的两条GABA受体亚基基因片段，推测其为二化螟GABA受体亚基的其他类型亚基基因片段。进一步明确完善了二化螟GABA受体亚基的序列，为深入研究二化螟GABA受体功能提供了更加完整的基础数据。

5. 研究计划与进展

2015.052015.08：二化螟的饲养。

2015.092015.10：二化螟的总rna的提取，以及合成cdna、5-race cdna、3-race cdna。

2015.102016.11：分析其他物种扥gaba受体亚基保守序列，设计兼并引物，并进行巢式pcr进行克隆验证。