转基因拟南芥、番茄构建与检测开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌hrp基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质,富含甘氨酸,缺少半脱氨酸,对蛋白酶敏感,对热稳定,大多对寄主植物具有毒性,导致寄主发病,能在非寄主植物上引起过敏反应,,增强植物杭旱性,诱导植物抗病、杭虫,还可以促进植物生长。popw是从青枯劳尔氏菌zj3721中鉴定出的编码一种新的harpin蛋白大小为1142bp的基因,其编码的popw蛋白是一种新的harpin蛋白,它同以前报道的类物质具有相同的性质酸性,富含甘氨酸和丝氨酸,缺少半胧氨酸并且是一种耐热蛋白。

hrp基因决定着革兰氏阴性植物病原细菌激发非寄主植物过敏反应能力(hr)和寄主植物的基本寄生性或致病性。hrp基因对决定细菌的致病性,但它并不能编码细菌一般生长、代谢所需的物质。到目前为止,在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中发现了基因。

大多数革兰氏阴性植物病原细菌都存在hrp基因,其决定抗病寄主或非寄主植物的过敏反应和病原菌对感病寄主的致病性(lindgrenetal.,1986;galanandcollmer,1999).hrp是一个包含许多基因的基因簇,其中包括编码Ⅲ型分泌系统的基因、编码被Ⅲ型分泌系统分泌的效应分子的基因和调节基因(alfanoandcollmer,1996,1997)。harpin是由革兰氏阴性植物病原细菌hrp基因编码的,通过Ⅲ型泌出通道分泌的一类效应蛋白。harpin蛋白都具有相似的生化特征:富含甘氨酸(gly)、缺乏半胱氨酸（cys）,热稳定,对蛋白酶敏感。有研究表明能够诱导植物产生系统杭性,并且该抗性属于水杨酸介导的sar。其主要功能是在病原菌致病过程中协助其它致病因子如avr和dsp等进入寄主细胞(galanandcollmer,1999;staskawicz,2001)。在非寄主上使用harpins,可引起植物产生多种有益反应,如提高作物的抗病、抗虫能力、促进植物生长和增强植物的抗逆性等,同时研究发现转harpin基因的作物对干旱、盐胁迫和冻害的各种逆境表现出较高的耐受性(dongetal.,1999;strobleetal.,1996;weietal.,1998),从各类病原菌中寻找产生harpin的hrp基因以及研究其诱导防卫反应机制已成为分子植物病理学一个新的研究热点。

2. 研究的基本内容和问题

采用青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组克隆的全长PopW以及PopW（1-159）和PopW（160-366），并构建在双元载体pMDC43载体上。利用三个构建的质粒和GV3101和LBA4404土壤农杆菌，分别侵染番茄愈伤组织和拟南芥花药，构建转基因突变体植株，并通过提取植物基因组，PCR验证检测。对比分析各个不同基因载体对寄主抗性及其他生理情况的影响，缩小Popw基因作用位点范围。

3. 研究的方法与方案

采用青枯劳尔氏菌zj3721基因组克隆的全长popw以及popw（1-159）和popw（160-366），并构建在双元载体pmdc43载体上。利用三个构建的质粒和gv3101和lba4404土壤农杆菌，分别侵染番茄愈伤组织和拟南芥花药，构建转基因突变体植株，并通过提取植物基因组，pcr验证检测。

可行性分析：

项目组所依托的植保学院植物病理系分子植物病理学实验室长期从事harpin蛋白相关研究，积累了丰富的经验，可以为本项目的实施提供理论指导。

4. 研究创新点

将Popw相关基因拆分，进一步缩小作用基因范围明确作用机理。同时在番茄和拟南芥两种不同寄主上进行转基因，对比出Popw蛋白对不同寄主的表现，以便于更广泛的推广使用。

5. 研究计划与进展

2015.08-2015.10培育拟南芥和番茄无菌苗并活化相关菌体

2015.09-2015.11制备转基因载体及构建农杆菌转化

2015.11-2016-03转基因植株检测及pcr验证