水稻稻瘟病菌效应因子AVR1-CO39的重组表达和纯化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

水稻作为世界三大经济作物之一，是全球50%以上人口的主食^[1]，与人们生活息息相关。然而由稻瘟病菌（magnaporthe oryzae，有性态；pyricularia oryzae，无性态）引起的病害是水稻产量损失最为严重的病害之一。全世界范围，每年由稻瘟病引起的水稻减产可以养育六千万人口^[2]，重病年甚至颗粒无收。稻瘟病菌被评为十大病原真菌之首^[3]。保障水稻产量与质量对解决人民温饱和粮食安全问题有着重要意义。

已知水稻与稻瘟菌之间符合基因对基因假说^[4]，即寄主植物中有一个抗性基因r，在病原真菌中就会对应存在一个无毒基因avr，抗性基因r和无毒基因avr产物的直接或间接互作会激发寄主产生防卫反应，继而对该病原菌的入侵表现出抗病性，当两者之间任何一个缺失或失活，植物就会感病。寄主的抗病性不仅与寄主品种本身的抗病基因型有关，还跟病原菌的基因型密切相关。

常年以来，植物与病原菌长期协同进化中形成了各自的防卫和进攻机制。植物对病原物的识别主要在细胞膜和细胞内两个层次。植物细胞膜上的模式识别受体 prrs（pattern recognition receptors）识别病原微生物保守的病原相关物分子模式 pamps（pathogen-associated molecular patterns）激发的免疫反应称之为 pti（pamp-triggered immunity）。病原物为了成功侵染往往会分泌效应因子到植物细胞胞内或者胞间质来抑制寄主植物的 pti，进而产生效应因子诱发寄主植物免疫反应即 eti（effector-triggered immunity）。植物与病原物在长期互作中促使了植物 r 蛋白和病原物效应因子的进化^[5]。植物 r 蛋白如何识别病原物效应因子并引发抗病反应已经成为植物病理学研究的热点之一。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

avr1-co39及其突变体进行重组表达并纯化，获得高纯度的目的蛋白。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1. 目的基因获取

利用PCR扩增技术扩增目的片段

2. 重组质粒的构建

利用Sticky-end技术，PCR扩增目的片段，构建不同的表达载体（如pETM20，pETM30，pHAT2，pETM13，pETM10，AD，BD等）。

3. 重组蛋白的表达

利用大肠杆菌表达体系表达重组蛋白。

4. 重组蛋白的纯化和鉴定

采用离子交换层析（Ion Exchange，IEX）、分子筛层析（Gel Filtration，GF）、亲和层析（Affinity Chromatography，AC）和疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）等技术纯化目标蛋白，并对纯化的样品应用动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）等方法确定蛋白状态聚合的均一性；应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度；对实验过程中疑似目标蛋白进行质谱(MassSpectrometry，MS)鉴定。

技术路线：

实验方案：

1. 重组表达载体构建

根据目的序列和载体性质设计引物，PCR扩增目的基因的片段，与已经双酶切好的载体连接。PCR扩增体系如表1-1，酶切和连接体系分别如表1-2,1-3。

表1-1 PCR扩增体系

表1-2 双酶切体系

表1-3 连接体系

2 蛋白的原核表达

2.1 蛋白的原核表达及表达条件优化

(1)取0.5 μL鉴定正确的重组质粒，热激表达菌株的感受态细胞（BL-21-D13或 Rosseta）中。

(2)从平板上挑取新鲜单菌落，转接到相应抗性的LB液体的5mL EP管中，37℃/220 rpm培养5-7个小时。

(3)吸取600μL菌液分装两个相同的5mLEP管，一管对照，一管加入0.1 Mmolaa的IPTG，过夜诱导。

(4)将对照与诱导12000rpm，1分钟离心，弃上清，各加1mL蒸馏水，悬挂，后离心，弃上清，加入20μL 2* loading buffer，悬挂，煮5分钟，12000rpm，1分钟离心，通过SDS-PAGE进行蛋白的表达鉴定。

2.2 目的蛋白的大量培养

(1) 吸取表达好的菌液到100 mL LB培养基中小量培养，220rpm，37℃过夜培养。

(2)培养菌液分装1 L 灭菌LB培养基，220 rpm，37℃培养至OD₆₀₀在0.6-0.8。

(3)加入IPTG终浓度为0.1mM，在适宜温度和条件下诱导表达。

(4) 4℃，6000rpm离心10 min收集菌体。

3目的蛋白纯化

3.1 亲和层析

(1)加1/20～1/50培养体积的菌体重悬缓冲液至收集的菌体细胞，使用振荡器将菌体充分振荡使之均匀分散。

(2) 加入终浓度1 mM的PMSF，2mM的DTT至菌体重悬液，冰浴中超声破碎4min （2 sec on，4 sec off，功率600 W）。

(3)超声原液在4 ℃离心30 min，13000 rpm，收集上清。

(4)使用5~10倍柱体积的蛋白缓冲液平衡His beads。

(5)用恒流泵将上清流过His beads。

(6)用10倍柱体积的蛋白缓冲液清洗His beads，目的是去除未结合或特异性结合的杂质。

(7)设置不同浓度的咪唑梯度并洗脱缓冲液洗脱蛋白，将洗脱液4℃保存，并通过SDS-PAGE检测纯化过程中的样品。

(8)将His beads用水冲洗干净后，加入20％乙醇，放置于4 ℃冰箱。

3.2分子筛层析

使用GE公司的Superdex^TM 75 10/300GL凝胶过滤层析柱进行分子筛纯化，整个纯化过程在4 ℃中进行。

(1)倍柱体积缓冲液（如20 mM Tris HCL，pH 8.0；150 mM NaCL）平衡Superdex75凝胶过滤层析柱；

(2)将蛋白样品浓缩至0.5 mL，使用注射器将蛋白注入上样环，柱子流速0.85 mL/min；

(3)收集目标蛋白；

(4) SDS-PAGE检测收集的峰值样品。

(5) 将蛋白反复浓缩，并用液氮冻存。

可行性分析：

1 实验室已建立一套成熟的原核蛋白表达系统，具有齐全的蛋白纯化仪器。

2本实验室同中国科学院生物物理研究所、清华大学、、英国Diamond同步辐射光源等单位具有良好的合作管理，为相关实验开展提供有利条件。

3申请人自课题开始，阅读大量相关文献并开展稻瘟菌致病相关蛋白的原核表达纯化，已基本掌握相关的技术，为顺利完成该课题提供了保障。

4. 研究创新点

特色或创新之处

结构生物学是研究生物大分子结构和生物学功能关系的重要手段，随着生物学领域对精确的生物大分子结构需求的日益增加，利用单晶x射线衍射法获取三维结构越来越受到重视，然而，生物大分子的结晶非常困难，限制了生物大分子的结构测定。

目前对生物大分子的生长机理、成核过程，基本的热力学和动力学参数等的认识很少，所以进行生物大分子的晶体生长研究非常必要。获取大量高纯度，可溶性好的蛋白有利于后期的晶体生长，可从蛋白质的角度解析稻瘟病的致病机理。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2015/9 2015/10 阅读大量文献，深入理解稻瘟病效应因子avr1-co39，并归纳整理前人实验，整理规划自己的实验方案。

2015/102015/11 构建不同的avr1-co39重组质粒，进行可溶性筛选，筛选载体与实验方法。选取相对表达量高，可溶性强的重组质粒。