无乳链球菌裂解酶PlyGBS0643关键结构域的分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义1.1裂解酶的作用、优点 近年来，多种超级耐药细菌的不断出现与传播给兽医临床医学及细菌性传染病的治疗带来了严峻的挑战，新抗生素在研发上也面临着技术以及商业的障碍。

而裂解酶对宿主细菌的裂解不受细菌耐药性的限制，有望应对细菌耐药性问题。

裂解酶体外应用时能快速水解革兰氏阳性菌的细胞壁，其作用不受细菌耐药性的影响，而且不易诱导细菌产生新的抗性。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究的目标1.1表达和纯化链球菌裂解酶各个结构域。

1.2对重组表达的裂解酶的酶活结构域的特性分析（包括酶学性质分析、裂解谱的构建、电镜观察），及裂解酶细胞壁结构域的功能进行分析。

2.研究内容2.1裂解酶各个结构域的表达与纯化 针对裂解酶各个功能结构域（酶活结构域、细胞壁结合结构域）的序列的orf设计表达引物，使用高保真dna聚合酶扩增片段，用双酶切法，只保留c端组氨酸标签（试验证实n端组氨酸标签干扰裂解酶的酶活性区域的正确折叠，导致重组裂解酶失去抑菌活性），连接至pet的质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞中进行表达。

3. 研究的方法与方案

1.1研究方法及方案1.1.1菌株和质粒 实验所用无乳链球菌gd201008-001强毒菌株分离自2010年8月份广东的罗非鱼，由本实验室保存。

pet28a 载体由本实验室保存。

商品化的大肠杆菌dh5α株感受态及bl21（de3）plyss 株感受态均购自北京博迈德生物公司，由本实验室保存。

4. 研究创新点

对细菌病的治疗，使用抗生素会导致细菌耐药性的增加，裂解酶的使用具有高效、不易产生耐药性、有明确的质控指标等优点。

本课题对裂解酶LysGBS0643的关键结构域进行剖析，有助于解析该裂解酶的作用机制，为其临床应用奠定理论基础。

5. 研究计划与进展

第一阶段（2017.92017.10）学习实验室操作规范，完善实验设计、熟悉相关操作。

第二阶段（2017.112017.12）对无乳链球菌裂解酶lysgbs0643三个结构域的目的基因扩增、蛋白表达和纯化。

第三阶段（2018.22018.4） 对无乳链球菌裂解酶lysgbs0643三个结构域表达的蛋白做酶学性质分析、裂解谱的构建、电镜观察、裂解酶细胞壁结构域的功能分析