一种中药复方对小鼠抗疲劳、耐低温、耐缺氧和免疫功能的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

[课题意义]

急性高原反应（acute mountain sickness, ams）是指人或动物体突然进入低氧、高寒、高海拔等高原地区或极端恶劣环境后，短时间内机体无法适应环境的急剧变化而产生的一系列生理反应。高原反应对急进高原地区等特殊作业环境的警犬危害尤为严重，引起视力和听力受损、思维能力全面下降、定向力及注意力明显减退，这种情况下警犬训练建立起来的条件反射迟钝，作业效率和效能明显降低。因此，如何快速有效地提高机体缺氧耐力、减轻ams反应程度，对于提升警犬的高原使用效率、保证警犬的战斗力，具有十分重要的临床意义。公安部南京警犬研究所结合中医抗高原反应的研究经验，以红景天单方为主药，通过辅以补气血、益肝肾的黄芪、枸杞等几味中草药配方进行复配，经提取、浓缩，研制出一种中药方剂，进而开发出警犬专用抗高原反应处方犬粮。本课题拟观察抗高原反应中药方剂在小鼠抗疲劳、耐低温、耐缺氧方面的效果，为抗高原反应犬粮的进一步开发与应用提供实验基础和研究依据。

[国内外研究概况、应用前景]

2. 研究的基本内容和问题

[研究目标]

观察抗高原反应中药方剂在小鼠抗疲劳、耐低温、耐缺氧方面的效果，为抗高原反应犬粮的进一步开发与应用提供实验基础和研究依据。

[内容]

3. 研究的方法与方案

[研究方法、技术路线、实验方案]

本实验设计参照《饲料和饲料添加剂管理条例》、《兽药管理条例》，技术路线依据《兽药试验技术规范汇编》、《兽药研究技术指导原则汇编》、《中药饲料添加剂的开发与应用（第二版）》，以小鼠为实验动物，以抗高原反应中药方剂为实验材料，主要针对该中药方剂的抗疲劳、耐低温、耐缺氧效果进行研究、评价，综合分析了小鼠常温负重游泳时间、游泳后小鼠血乳酸、血尿素氮、肝糖原含量，小鼠耐低温实验，受试小鼠常压缺氧存活时间、亚硝酸钠（nano₂）中毒存活时间、急性脑缺血性缺氧存活时间等情况，为抗高原反应犬粮的进一步开发与应用提供实验基础和研究依据。

1. 受试小鼠的随机分组及灌胃设计小鼠检疫后适应性喂养5d，给药前禁食8 h，给药后禁食4 h，但不限制饮水。将340只小鼠随机分配到对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。以警犬每日推荐摄入量（0.2 g / kg）的5倍、10倍、20倍作为低、中、高剂量，即低剂量组（1 gkg^-1d^-1）、中剂量组（2 gkg^-1d^-1）、高剂量组（4 gkg^-1d^-1），对照组灌以等量生理盐水。每日定时灌胃，连续7 d，排除因灌胃损伤意外死亡的小鼠后，进行各项实验。

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   4. 研究创新点

   目前红景天等传统中草药已经被广泛开发应用于人体的抗高原反应，却很少有相关产品应用于动物体的抗高原反应。而警犬常常会急进高原地区等特殊作业环境，在这种情况下视力和听力受损、思维能力全面下降、定向力及注意力明显减退，因此警犬训练建立起来的条件反射迟钝，作业效率和效能明显降低。公安部南京警犬研究所结合中医抗高原反应的研究经验，以红景天单方为主药，通过辅以补气血、益肝肾的黄芪、枸杞等几味中草药配方进行复配，经提取、浓缩，研制出一种中药方剂。本课题拟观察该抗高原反应中药方剂在小鼠抗疲劳、耐低温、耐缺氧方面的效果，从而进一步开发出抗高原反应犬粮，提升警犬的高原使用效率、保证警犬的战斗力。

   5. 研究计划与进展

   [研究计划]

   1. 实验动物与饲养管理

      实验动物：选择健康、未曾交配、体况相近的ICR小鼠，体重20 g ± 2 g，共320只，其中雄性170只、雌性170只，由南京盛民科研动物养殖场提供。 饲养管理：饲养条件达到实验动物建筑设施标准、实验动物饲育空气质量标准、环境噪声标准，室温温差24 ℃ ± 5 ℃，相对湿度60 % ± 20 %，明/暗时间12 h / 12 h。鼠粮、垫料由南京盛民科研动物养殖场提供。

   2. 实验设计

      1. 受试小鼠的随机分组及灌胃设计小鼠检疫后适应性喂养5d，给药前禁食8 h，给药后禁食4 h，但不限制饮水。将340只小鼠随机分配到对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。以警犬每日推荐摄入量（0.2 g / kg）的5倍、10倍、20倍作为低、中、高剂量，即低剂量组（1 gkg^-1d^-1）、中剂量组（2 gkg^-1d^-1）、高剂量组（4 gkg^-1d^-1），对照组灌以等量生理盐水。每日定时灌胃，连续7 d，排除因灌胃损伤意外死亡的小鼠后，进行各项实验。

         依据《兽药管理条例》、《中药饲料添加剂的开发与应用（第二版）》中有关规定，小鼠常温负重游泳实验结果阳性，且运动后肝糖原、血乳酸、血尿素氮三项生化指标中任两项指标阳性，可判定该方剂具有抗疲劳效果；小鼠耐低温实验结果阳性，可判定该方剂具有耐低温效果；小鼠常压缺氧存活实验、急性脑缺血性缺氧存活实验、NaNO₂中毒存活实验三项实验中任两项实验结果阳性，可判定该方剂具有耐缺氧效果。

      2. 小鼠负重游泳实验 分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min后称重，在每只小鼠背部固定5 %体重的铅坠，松紧度适宜，立刻将各组小鼠分别置于游泳箱中游泳，控制水深不低于30 cm、水温24 ℃ ± 0.5 ℃、且使小鼠均无支持物攀附、持续游泳。立即按下秒表，观察各组小鼠游泳情况，准确记录小鼠从入水至力竭（小鼠头部完全沉入水中10 s不起）的时间，即为小鼠负重游泳时间。

      3. 小鼠运动后肝糖原、全血乳酸、血尿素氮含量实验分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30 min后，立刻将各组别小鼠分别置于游泳箱中无负荷游泳，控制水深不低于30 cm、水温24 ℃ ± 0.5 ℃、且使小鼠均无支持物攀附。准确计时使小鼠游泳90 min后取出，立即进行眼球采血，装入混有抗凝剂（肝素钠）的离心管中。取血后脱颈椎处死，剖解小鼠后取新鲜肝脏。按照试剂盒说明书测定样本肝糖原、血乳酸、尿素氮水平。

      4. 小鼠低温存活时间实验分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30 min后，立刻将所有小鼠混装于铁丝笼中并置于-20 ℃冰箱中，20 min后每隔1 min观察小鼠存活情况，记录各组小鼠死亡数量。

      5. 小鼠常压耐缺氧存活时间实验分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30 min后，立刻将每只小鼠分别置于装有25 g碱石灰（干燥剂）的250 mL广口瓶中，并用膏状白凡士林完全封闭瓶口。观察并记录各组小鼠状况，准确记录小鼠死亡（心跳呼吸完全停止）时间，即为小鼠常压耐缺氧存活时间。

      6. 小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间实验分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30 min后，将小鼠乙醚麻醉，用手术剪立刻从小鼠双耳连线处断头处死，准确记录小鼠自断头至张口喘气完全停止的时间，即为小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间。

      7. 小鼠亚硝酸钠中毒后存活时间的实验分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30 min后，称重，按照230 mg/kg的剂量逐只腹腔注射NaNO₂，准确记录小鼠自注射至心跳呼吸停止的时间，即为小鼠NaNO₂中毒存活时间。

   3. 统计方法

      实验数据录入EXCEL软件进行初步处理，后采用SPSS 24.0统计软件进行t检验。实验数据用“平均值±标准差”（`x ± SD）表示。差异判断标准为：P0.05表示差异显著具有统计学意义，0.05P0.1表示差异趋于显著。

      [预期进展]

   主要内容	预期完成时间
   熟练小鼠灌胃操作，拟好实验计划，置备好实验所需器材、试剂等	2018年9月初-2018年9月中旬
   小鼠常温负重游泳时间实验	2018年9月下旬-2018年10月初
   小鼠运动后血乳酸、血尿素氮、肝糖原含量实验	2018年10月中旬-2018年10月末
   小鼠耐低温实验	2018年11月初-2018年11月中旬
   小鼠常压缺氧存活时间	2018年11月下旬-2018年12月初
   小鼠亚硝酸钠中毒存活时间	2018年12月中旬-2018年12月末
   小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间	2019年1月初-2019年1月中旬
   数据处理、实验论文及相关材料撰写	2019年3月-2019年5月

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