杭菊黄酮合成酶基因（FNS II）克隆及表达分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1选题意义

菊花是我国传统中药材，常用的解表药之一，是菊科植物菊（chrysanthemum mifolium ramat.）的干燥头状花序，始载于《神农本草经》。药材按产地、加工方法不同，可分为“杭菊”、“亳菊”、“贡菊”、“怀菊”、“滁菊”五大类^[1]，杭菊是其中一大类。杭菊是常用的药食同源药，既可以药用也可以泡茶，在中国历史上作为茶点饮料用，有“茶菊”之名^[2]。杭菊有杭白菊和杭黄菊之分，杭白菊主产于浙江桐乡、江苏射阳和湖北麻城三大产区，分别主产湖菊、小白菊、大白菊，长于养肝明目，为首选护眼佳品；杭黄菊主产于江苏射阳，长于疏风清热，多用于治风热感冒、咽喉疼痛等证。其中桐乡和射阳出现杭菊新兴加工品胎菊，引种产区均出现早菊。由于长期人工栽培和选育，杭菊产生了多样品种，其习性各异，适应不同产地环境。在五大类药用菊花中，每一大类菊花在长期的栽培种植和人工选育中形成了各自不同的栽培类型，不同产地杭菊植物学性状差异显著，随着引种栽培环境的改变，杭菊植物学性状发生了一定的改变。据报道，杭菊就形成了共9个栽培类型，其中传统的杭菊栽培类型为早小洋菊、迟小洋菊、异种大白菊及大洋菊、香溢、金菊1号、金菊2号、金菊3号和金菊4号为近年来新培育的栽培类型^[3]。小洋菊是杭菊的一大栽培类型，早小洋菊是在小洋菊栽培类型中发现的一个变异单株经无性繁育得到的新栽培品种，性状优良、抗性好、优质、稳产、成熟早，总黄酮含量达3.10^[4]，是本次实验研究的原材料。《中国药典》（2015年版）中明确将木犀草苷、3，5-o-二咖啡酰基奎宁酸和绿原酸作为杭菊的质量指标，并规定含木犀草苷（c₂₁h₂₀o₁₁）不得少于0.080，可见黄酮类成分是其重要的活性成分之一，用于鉴定杭菊的真伪优劣，与其临床疗效密切相关。本课题主要研究杭菊中黄酮合成酶的基因，通过采集原材料，提取rna，反转录成cdna，设计引物进行基因克隆，再进一步进行基因序列分析及不同时期的基因表达水平分析，探索杭菊中黄酮类成分的合成机制。

2杭菊黄酮国内外研究进展

2. 研究的基本内容和问题

1研究目标

（1）在分析自身生长性质因素时，从基因水平探讨影响早小洋菊黄酮类成分积累合成因素，基于大量相关文献和生物分子学研究理论挖掘未经发现的影响早小洋菊黄酮类成分次生代谢产物合成途径中的关键酶基因1个。

（2）筛选出1个具有典型性和代表性的基因，将其进行定位、定性和定量分析，克隆；并利用实时定量（qpcr）分析关键酶基因在不同时期的基因相对表达量水平。

3. 研究的方法与方案

1研究方法

采集正在生长旺期的早小洋菊叶片作为原材料，在液氮下冷冻研磨，提取rna，反转录成cdna，设计引物进行基因克隆，进一步进行基因序列分析，使用荧光定量pcr研究相关基因的表达效果及不同时期的基因相对表达水平，在转录和代谢水平上进行基因的评价，探索杭菊早小洋菊中黄酮类成分的合成机制。

4. 研究创新点

目前，黄酮合成酶fnsii的基因已在黄芩、短葶飞蓬、金银花、粘毛黄芩、水母雪莲、紫苏等植物中克隆，但有关杭菊黄酮合成的关键酶基因fnsii的信息尚未见报道，因此该基因的挖掘及分析有利于进一步研究早小洋菊中类黄酮类次生代谢产物的代谢途径，有利于探索植物的防御反应机制，有利于充实影响杭菊黄酮类成分次生代谢产物合成积累的关键合成酶基因库。

本研究采用了基因组学的研究方法，拟从分子水平挖掘影响杭菊黄酮合成积累的的关键酶基因fnsii，通过前期大量分析转录组数据定位到相关基因后，将其基因克隆，使用荧光定量pcr分析基因表达效果及不同时期的基因相对表达水平，为在杭菊植物体外人工调控合成黄酮类成分以提高杭菊的药用食用品质、临床疗效提供可供参考的方法。

此外，本次研究实验充分利用了多种现代生物分子学仪器分析方法和分子生物学研究手段，基于分子生物学及生物化学理论知识对中药材中常见的一大类生物活性成分黄酮类成分的含量及调控合成表达进行定量测定和相关分析。

5. 研究计划与进展

本研究计划在2019.09-2020.05完成：

（1）2019.09-2019.11：对通过利用早小洋菊实验材料，提取其rna，反转录成cdna，设计引物进行基因相关的克隆和定位。

（2）2019.11-2020.03：通过分析前期转录组数据定位到相关基因后，使用荧光定量pcr及相关技术研究相关基因表达效果。