大蒜总皂苷提取工艺及其抑菌活性研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.1 研究背景
1.1.1 大蒜简介
大蒜（英文名称Garlic；拉丁名称Allium sativum L.）是百合科、葱属植物的地下鳞茎。大蒜整棵植株具有强烈辛辣的蒜臭味，蒜头、蒜叶（青蒜或蒜苗）和花薹（蒜薹）均可作蔬菜食用，不仅可作调味料，而且可入药，是著名的食药两用植物。大蒜鳞茎中含有丰富的蛋白质、低聚糖和多糖类、另外还有脂肪、矿物质等。大蒜具有多方面的生物活性，如防治心血管疾病、抗肿瘤及抗病原微生物等，长期食用可起到防病保健作用。大蒜营养丰富，据报道，大蒜中的含水约为70%，蛋白质含约为4.4%，脂肪含约为0.2%，糖类含约为23%，粗纤维含量约为0.7%，灰分含量约为1.3%。同时,大蒜还富含钙、铁、尼克酸、抗坏血酸、硫胺素、核黄素以及多种人体必需的微量元素，如硒、锌、等；大蒜中还含有赖氨酸、氨酸、缬氨酸等17种重要的氨基酸。
1.1.2 大蒜皂苷种类及结构
皂苷( saponin )又称碱皂体、皂素、皂甙、皂角苷或皂草苷，由皂苷元与糖构成。皂苷根据结构不同，可分为三萜皂昔和甾体皂苷，一般存在于植物和海洋生物中，具賄良好的生物和药理功效。大蒜皂苷中三萜皂苷较少，绝大部分为甾体皂苷。甾体皂苷又分为螺甾皂苷和吠甾皂苷，以螺甾皂苷生理活性较显著。呋甾皂苷和螺甾皂苷是大蒜最主要的两种皂苷，大蒜呋甾皂苷在β-葡萄糖苷酶作用下生成，二者均具有降血脂、抗肿瘤、抑菌等生理功效。
1.1.3 大蒜抗菌功效
大蒜的抗菌活性来源于大蒜素对多种微生物的抑制，包括志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪球菌、化脓链球菌、肠道沙门氏菌、产汽克雷伯菌、弧菌、分枝杆菌、 寻常变形杆菌以及粪肠球菌。大蒜的抗菌原理为细菌生长繁殖必须要半胱氨酸，而大蒜素分子中的氧原子可与半胱氨酸分子中的疏基相结合，从而抑制细菌的生长和繁殖。
大蒜提取物对包括念珠菌属、环孢菌属、孢菌属、隐球菌属、曲霉属、孢菌属和红球菌属在内的多种真菌具有广谱的杀菌作用。此外，从大蒜中提取的皂苷对灰葡萄孢和哈兹木霉也表现出抑菌活性。大蒜提取物通过影响真菌细胞壁，破坏真菌细胞的结构，导致细胞结构完整性丧失，影响其萌发能力。大蒜提取物通过穿透细胞膜以及线粒体等细胞器膜，导致细胞器破坏和细胞死亡。
1.1.4 大蒜皂苷研究进展
1982年SmoczkiewiczMA等在大蒜提取物中用薄层层析法检测到甾体皂苷；1988年MatsuuraH等第一次从冻干的大蒜乙醇提取物的天然糖苷中分离出proto-eruboside-B，进一步发现和分离了sativoside-Bl和proto-desgalac totigonin。这些研究表明大蒜的加工还会产生甾体皂苷。据日本学者Hiromichi报告得知大蒜的两种新甾体皂苷Sativoside-R1和sativosid-R2，它们的结构是glueo-proto-desgalaeto-tigonin和相应的螺甾皂苷。彭军鹏等从大蒜水溶性部分又分离得到两个新的甾体皂甙类化合物，一个是呋甾皂甙Proto-iso-eruboside B，另一个为螺甾皂甙iso—eru-boside B，另外还有螺甾皂甙eruboside B和Sativoside C。确定Proto-iso-eruboside B的结构为26-O-β-吡喃葡萄糖基-22-羟基-25(S)-5α-呋甾-3β，6β，26-三醇3-O-β-吡喃葡萄糖基(1→2)-[β-吡喃葡萄糖基(1→3)]-β-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-吡喃半乳糖甙；确定iso-eruboside B结构为β-异绿配基(neochlorogenin)-3-O-β-吡喃葡萄糖基(1→2)-[β-吡喃葡萄糖基(1→3)]β-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-吡喃半乳糖甙。进一步随eruboside-B分离出新的螺甾皂苷，Sativoside-B2，-B3，-B4，和-B5。Sativoside-B4和-B5有一个新糖苷，即27-羟-β-绿莲皂苷元。到目前为止，已陆续从大蒜中提取分离鉴定了20种皂苷类化合物。
1.1.5 研究目的
大蒜是重要的药食两用植物。国内外研究结果表明，大蒜除含大蒜素、大蒜多糖等活性成分，还富含皂苷类活性物质（甾体皂苷）。大蒜皂苷(Garlic saporlins，GSP)具有降血脂、抗缺氧等活性，可显著增强人体免疫力，有重要的药用开发价值。本论文以大蒜为材料，拟采用单因素及响应面法结合超声波辅助提取技术对大蒜总皂苷提取工艺进行优化，并对大蒜总皂苷抗菌活性进行测试和评价，旨在为大蒜资源的进一步开发利用及寻找新的抗菌化合物提供科学依据。

2. 研究内容和预期目标

2.1.1 主要研究内容
（1）大蒜材料准备与处理；
（2）大蒜总皂苷提取单因素试验；
（3）大蒜总皂苷BOX-Behnken中心组和响应面优化实验；

（4）大蒜总皂苷抑菌活性测定。

2.2 预期目标
（1）将大蒜材料干燥并做粉碎处理；
（2）用浸提法提取大蒜皂苷并完成单因素试验；
（3）进行大蒜总皂苷BOX-Behnken中心组及响应面优化实验；
（4）完成大蒜皂苷体外抗氧化活性测定；
（5）完成大蒜皂苷抑菌活性测定。

3. 研究的方法与步骤

3.1 大蒜材料准备与处理
将晒干的大蒜用粉碎机粉碎，过80目筛，无法过筛的部分可再次粉碎一段时间，将过筛后的大蒜密封装于称重好的PE袋中称重，标记好重量以及磨粉日期，放于干燥阴凉处备用。
3.2 大蒜总皂苷提取单因素试验
3.2.1 乙醇体积分数对皂苷得率的影响
固定提取温度 50 ℃、超声波功率 300 W、提取时间 30 min、液料比 20∶1，考察乙醇体积分数40、50、60、70、80、90％对皂苷得率的影响。
3.2.2 提取时间对提取率的影响
固定乙醇体积分数60％、提取温度 50 ℃、超声波功率 300 W、液料比 20∶1，考察提取时间10、20、30、40、50min对皂苷得率的影响。
3.2.3 液料比对提取率的影响
固定乙醇体积分数60％、提取温度 50℃、提取时间 30 min、超声功率 300 W，考察液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）对皂苷得率的影响。
3.2.4 提取温度对提取率的影响
固定乙醇体积分数60％、提取时间 30 min、超声波功率 300 W、液料比 20∶1，考察超声时间为10、20、30、40、50min对皂苷得率的影响。
3.2.5 超声波功率对提取率的影响
固定乙醇体积分数60％、提取温度 50 ℃、提取时间 30 min、液料比 20∶1，考察超声功率为100、200、300、400、500、600W对皂苷得率的影响。
3.3 大蒜总皂苷BOX-Behnken中心组和响应面优化实验
以单因素试验为基础，基于Box-Behnken的中心组合设计原理，响应面分析优选超声波辅助提取皂苷的最佳提取条件。以大蒜总皂苷得率为响应值，选择乙醇体积分数、提取时间、提取温度及超声波功率为考察因素自变量，设计四因素三水平响应面法优化提取工艺。

3.4 大蒜皂苷体外抗氧化活性测定

使用DPPH和FRAP法对大蒜皂苷进行体外抗氧化活性研究。DPPH法中，将样品与DPPH溶液混合，摇匀，在25 ℃左右的黑暗环境中反应半小时，用分光光度计在波长515 nm处测定吸光度值。用DMSO代替样品作为空白对照，Vc为阳性对照。FRAP法中，做出硫酸亚铁标准曲线。以10：1：1的体积比混合醋酸钠缓冲液、TPTZ溶液和三氯化铁溶液成FRAP工作液。硫酸亚铁作为标准品，样品的铁还原能力以每毫克样品对应硫酸亚铁的浓度表示，为FRAP值。FRAP值越大，表示其铁还原能力越强。将样品与FRAP工作液混合，在37 ℃水浴锅中反应8 min，于593 nm处测定其吸光度并记录相应数据。

3.5 大蒜皂苷抑菌活性测定
选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作为试验菌，用滤纸片法测定提取物的抑菌圈大小，用酶标法测定提取物对于每种菌的MIC值和MBC值，对各提取物的抗菌活性进行分析。
在培养皿外壁用记号笔标记四个滤纸片1、2、3、4分别对应样品、阳性对照、阴性对照和空白对照。其中，阳性对照为恩诺沙星，阴性对照为20％DMSO，空白对照为水。用移液枪分别吸取恩诺沙星5 μL、其余溶液10 μL滴于四个滤纸片中心，置于37 ℃恒温培养箱中培养大约6~12 h，通过观察滤纸片1的抑菌圈大小确定样品对各菌的抑菌活性。
使用96孔板测定大蒜皂苷无水乙醇提取物对各菌的MIC值，每个样品浓度与菌种均设立三个平行孔格，用20％DMSO将样品浓度稀释为500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.8125 mg/mL、3.90625 mg/mL。设置96孔格的1A~3H为大肠杆菌的样品孔格、5A~7H为金黄色葡萄球菌的样品孔格、9A~9C为大肠杆菌的阴性对照（20％DMSO）孔格、9E~9G为大肠杆菌的阳性对照（恩诺沙星）孔格、11A~11C为金黄色葡萄球菌的阴性对照（20％DMSO）孔格、11E~11G为金黄色葡萄球菌的阳性对照（恩诺沙星）孔格。1A~3H孔格中加入100 μL稀释后的各浓度的大蒜总皂苷无水乙醇提取物溶液和100 μL的大肠杆菌菌悬液，5A~7H孔格中加入100 μL稀释后的各浓度的大蒜总皂苷无水乙醇提取物溶液和100 μL的金黄色葡萄球菌菌悬液，9A~9C孔格中加入100 μL的20％DMSO（阴性对照）和100 μL的大肠杆菌菌悬液，9E~9G孔格中加入100 μL的恩诺沙星（阳性对照）和100 μL的大肠杆菌菌悬液，11A~11C孔格中加入100 μL的20％DMSO（阴性对照）和100 μL的金黄色葡萄球菌菌悬液，11E~11G孔格中加入100 μL的恩诺沙星（阳性对照）和100 μL的金黄色葡萄球菌菌悬液。将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，使用酶标仪测定，判断大蒜皂苷无水乙醇提取物对各菌的MIC值。
将上述样品接种板中无可见菌生长的各孔中，每个同一平行样中吸取100 μL液体接种涂布于同一琼脂平板，细菌试验对应的培养基经30-35℃培养24h后观察结果。以无可见菌落生长（或可见菌落＜5）定为孔格中的菌被100%被杀灭，而这一孔格的浓度就是其MBC值。

4. 参考文献

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5. 计划与进度安排

进度安排：2024年12月19日—2024年5月19日
1、第17周（22-23-1学期）-第2周（2024年12月19日--2024年3月6日）接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告；
2、第3周（2024年3月7日--2024年3月13日）大蒜材料干燥、粉碎预处理；
3、第4周-第8周（2024年3月14日--2024年4月17 日）大蒜总皂苷提取单因素试验；
4、第9-11周（2024年4月18日--2024年5月7日）大蒜总皂苷BOX-Behnken中心组及响应面优化实验；
5、第12周（2024年5月8日--2024年5月15日）大蒜总皂苷抑菌活性测定；
6、第13周（2024年5月15日--2024年5月19日）分析数据、撰写毕业论文和答辩PPT。