5-羟色胺对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义：哺乳母猪是否能产生足够的乳以满足仔猪生长的需要可以影响养猪业的健康发展。因为乳可以为新生幼仔提供营养、免疫保护和代谢信息。可以说乳中含有幼畜生长发育所需的一切营养成分，是最适初生期动物的食物来源。营养能够调控泌乳已见报道且已有相应的理论基础，原因在于乳腺的实质组织，乳中的酪蛋白、乳糖以及合成乳脂的短链脂肪酸等均由乳腺细胞利用前体小分子物质合成，在泌乳这一特殊生理时期，显然对营养有更高的要求。色氨酸是动物维持生长的必需氨基酸之一，其在体内先后经过色氨酸羟化酶、5-羟色胺氨酸脱羧酶的作用而催化生成5-羟色胺（5-ht）。5-羟色胺具有调控钙离子分配的功能，钙离子的分配被证实和乳的发生有重要的联系。本研究拟运用现代营养学、分子生物学和高通量组学等技术手段，探讨5-ht对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。研究通过营养调控泌乳，增加乳的产量不仅可以缓解产仔数增加造成的泌乳量不足的矛盾，而且对养猪产业有重要的战略意义。

国内外研究概况：泌乳是在妊娠发育、泌乳、衰退――再次妊娠发育、泌乳、衰退的循环过程中进行的；在这一过程中，乳腺包含的分泌细胞和各种间质细胞间的信息交流是成功泌乳的物质基础。激素是乳腺细胞间交流，泌乳的启动、发生及调控的重要媒介。研究发现，在母猪分娩的前2-3周乳腺生乳过程就开始诱导，这早于传统的认知。怀孕的80d左右β-乳球蛋白开始在乳腺的实质中合成，100d左右酪蛋白合成开始，并从110d起合成大量增加，这是泌乳启动的第1阶段或早期阶段；泌乳启动的第2阶段，以大量的乳汁分泌为特征，发生在分娩前后，这一阶段可延伸至分娩后的最初几天。在泌乳启动的早期雌激素、孕酮、催乳素发挥着重要的作用。在整个泌乳期，催乳素、生长激素、糖皮质激素和甲状腺素等促进乳的分泌。此外，乳的产量调控同样离不开激素的作用。1955年，brumby 和hancock首次对奶牛长期注射牛生长激素，成功提高了泌乳奶牛的乳产量。随后，大量的研究报道表明，应用gh后奶产量平均增长20%-30%，即每日增产5-7kg牛奶，最高可达40%左右。

营养能够影响一切生理活动（包括内分泌）。已有大量研究表明，营养的改变能影响和泌乳相关的激素及激素的释放，如催乳素、胰岛素、生长激素、黄体生成素、卵泡刺激素等。有报道称泌乳期增加蛋白的供应能促进乳腺的发育及提高泌乳期乳的产量。也有报道表明妊娠期的高能量日粮能促进乳腺发育及泌乳期的乳产量，而高蛋白日粮对乳腺的发育没有影响，但可以促进乳产量。泌乳期营养需求的增加显然和泌乳需求有关，同时母猪体型增大、体脂降低也对营养提出了更高的要求。氨基酸营养是现代营养学研究的热点之一。氨基酸在泌乳过程中的意义在于用于乳腺上皮细胞合成蛋白质。研究证实，给泌乳母猪提供足量的、适当比例的氨基酸，对提高泌乳是必要的。lys、val、ile、arg等能提高母猪泌乳、改善乳品质已见报道。如wilson et al（1996）的报道显示日粮额外添加赖氨酸能够提高仔猪窝重，缩短断奶、发情间隙，增加下个胎次仔猪数量，提高泌乳量。rousselow et al（1980）指出额外添加缬氨酸能增加泌乳量和仔猪的断奶窝重。richert et al（1997）发现分别添加缬氨酸、异亮氨酸或增加总的支链氨基酸的含量同样对增加初生窝重和断奶窝增重（断奶窝增重增加在某种意义上代表泌乳量增加）有重要意义。

2. 研究的基本内容和问题

目标：研究将通过分离培养原代猪乳腺上皮细胞，在培养的一定阶段分别加入5-ht（设对照）、5-ht 5-ht 摄取抑制剂、5-ht 摄取抑制剂，继续培养一段时间后收集样品。检测不同处理 ，验证5-ht是否对乳腺上皮细胞具有直接或间接的影响，最终达到阐明5-ht对母猪泌乳能力的影响。

内容：从理论上讲，色氨酸参与并调控蛋白的合成，同时色氨酸在体内的代谢主要是在色氨酸羟化酶作用下转化成5-ht，5-ht具有调控钙离子分配的功能，钙离子的分配被证实和乳的发生有重要的联系。而乳腺上皮细胞是乳合成的工厂， 5-ht（直接还是间接）是否影响乳腺上皮细胞的、乳的发生及其机理。本研究分离培养原代猪乳腺上皮细胞，在培养的一定阶段分别加入5-ht、5-ht 5-ht 摄取抑制剂（设对照）、5-ht 摄取抑制剂，继续培养一段时间后收集样品。检测不同处理对乳腺上皮细胞乳糖及脂肪酸合成能力（乳糖合成酶及脂肪酸合成酶）的影响，对乳腺上皮细胞酪蛋白分泌能力的影响。通过实验从细胞水平验证5-ht对乳腺上皮细胞的泌乳能力具有影响。

拟解决的关键问题：（1)阐明分离培养原代猪乳腺上皮细胞，在培养的一定阶段分别加入5-ht（设对照）、5-ht 5-ht 摄取抑制剂、5-ht 摄取抑制剂，阐明5-羟色胺影响乳腺上皮细胞的泌乳调控。（2)各项参数的确定、后期数据的统计处理

3. 研究的方法与方案

研究方法：分离培养原代猪乳腺上皮细胞，在培养的一定阶段分别加入5-ht（设对照）、5-ht 5-ht 摄取抑制剂、5-ht 摄取抑制剂，继续培养一段时间后收集样品。检测不同处理 （1）对乳腺上皮细胞乳糖及脂肪酸合成能力（乳糖合成酶及脂肪酸合成酶）的影响。试剂盒检测乳糖合成酶及脂肪酸合成酶的活性。具体方法参照试剂盒说明。（2）对乳腺上皮细胞酪蛋白分泌能力的影响。 细胞裂解后，蛋白定量，然后取等量蛋白样品进行电泳、转膜，牛血清白蛋白封闭，一抗、二抗依次孵育洗涤后，用化学发光液发光，并以gapdh作为内参进行光密度测定及相对表达的计算。达到从细胞水平验证5-ht对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响的目的。

技术路线:

（见附件）

4. 研究创新点

泌乳受神经激素调节，但激素的作用往往通过大量的蛋白介导起作用（涉及复杂的信号通路），运用现代营养学、分子生物学和高通量组学等技术手段，阐明相关激素、蛋白（尤其是乳清中的泌乳调控因子）在乳的生成及分泌中的作用将为利用营养调控手段提高母猪泌乳水平提供实验和理论支持。

5. 研究计划与进展

1.分离培养原代猪乳腺上皮细胞。

2.实验分组，在分离培养原代猪乳腺上皮细胞的一定阶段分别加入5-ht（设对照）、5-ht 5-ht 摄取抑制剂、5-ht 摄取抑制剂，继续培养一段时间后收集样品。

3.研究对乳腺上皮细胞乳糖及脂肪酸合成能力（乳糖合成酶及脂肪酸合成酶）的影响。