猪圆环病毒2型的分离与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒病(porcine circovirus diseases,pcvd)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, pcv2)引起断奶仔猪以消瘦、皮肤苍白、黄疸、淋巴结肿大、腹泻等症状为特征的多系统衰竭传染病^[1]。

猪圆环病毒(porcine circovirus,pcv)是圆环病毒科圆环病毒属成员，为已知的最小的动物病毒之一,其病毒粒子无嚢膜，基因组是由一条单股、负链、环状的组成,有和两个基因型^[2]，根据其抗原性及基因组成不同，分为2种基因型或称血清型，即pcv 1及pcv2 。 pcv1基因组全长为1759bp，pcv2为1767bp或1768bp两种基因组长度。同一血清型(基因型)内部各毒株核甘酸序列保守度很高，同源性可达90%以上，而2种血清型毒株间的序列相似度低于80%^[4]，是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原。

pcv2病毒主要侵害8～12周龄仔猪，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症、猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、仔猪先天性震颤、增生性坏死性肺炎、肠炎等多种疾病的发生^[1]，除此之外，还可引起断乳仔猪间质性肺炎、淋巴组织萎缩及肉芽肿性炎症、坏死性肝炎、间质性肾炎和心肌炎等多系统损伤性病理变化^[4]，猪对pcv2有很强的易感性，病毒可以通过感染猪的粪便、鼻液等排泄物排出，然后再通过呼吸、口腔等传播途径感染不同年龄的猪^[3],给世界养猪业带来了巨大的经济损失。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：将从江苏某猪场采取的病料接种在pk-15细胞上进行不断的传代，争取分离到pcv2病毒，进行普通pcr和荧光定量pcr鉴定，接着进行间接免疫荧光鉴定及tcid₅₀毒力测定，如果毒力达到标准再进行小鼠的致病性实验。

研究内容：1.首先掌握pk-15细胞的传代培养技术

2.将从江苏某猪场获取的病料接种在pk-15细胞上进行传代培养

3. 研究的方法与方案

研究方法：1.细胞传代技术；2.细胞接毒传代技术； 3.提取病毒dna技术； 4.普通pcr技术； 5.荧光定量pcr技术；6.tcid₅₀技术；7.间接免疫荧光技术；8.做小鼠致病性实验

技术路线：

前期准备：熟练pk-15细胞的传代技术

4. 研究创新点

本实验运用人工传代培养，多次传代过后病毒如果增殖，进行间接免疫荧光鉴定，再进行TCID₅₀测毒力，如果毒力达标准进行小鼠攻毒实验，此实验为做免疫原性实验奠定了基础。

5. 研究计划与进展

第1-4周（2017.10.09-2017.11.09）练习pk-15细胞的传代培养。

第5-9周（2017.12.25-2018.01.17）进行接毒pk-15细胞的传代培养，提取病毒的dna。

第9-12周（2017.12.25-2018.01.17）继续进行接毒pk-15细胞的传代培养，普通pcr的鉴定。