金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的表达、纯化及活性检测开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义及现状分析金黄色葡萄球菌是环境中普遍存在的革兰氏阳性菌，致病能力强，在畜牧业金黄色葡萄球菌是引起仔猪腹泻、伤口感染及奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，近年来随着抗生素的使用日益增多，金黄色葡萄球菌的耐药性也不断增强，同时人们对食品中抗生素残留问题的担忧，导致寻找新的抗菌剂势在必行[1]。

噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成自我生长和增殖、通过裂解细菌将自身释放到坏境中的微小生物，因其识别宿主的专一性，不会对其他细菌造成杀伤，因此不会产生残留危害的问题，且使用噬菌体无副作用，细菌很难对噬菌体产生抗性，因此，噬菌体被认为是治疗细菌感染和环境消毒的有效手段。

在噬菌体发现之初，科学家们便意识到其在细菌性疾病防制方面的应用价值，故做了大量试验研究其生物学特性。

2. 研究的基本内容和问题

2.项目研究的目标、内容和拟解决的关键问题2.1研究目标噬菌体通过裂解酶裂解宿主菌，在使用噬菌体或者其裂解酶进行疾病治疗上，人们更能接受裂解酶。

并且事实上使用裂解酶，其优点众多：能与噬菌体共同进化；具有更强的特异性；产生耐药性的可能性更低；相比于目前抗生素的使用情况，其相关新闻还没有口服产生过敏的现象报道；对于生产相关药物，可以建立并实现明确的质控标准，具有着很高的开发前景与潜在价值。

此实验现阶段，利用嵌合裂解酶ap-lys1基因与pet32a原核表达载体合成的重组表达质粒pet32a-ap-lys1，通过将重组表达质粒导入转化大肠杆菌top感受态细胞中来获取重组菌。

3. 研究的方法与方案

3. 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析3. 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析3.1材料和方法 3.1.1菌株金黄色葡萄球菌标准菌种：atcc25923、cmcc26001（此实验室购自美国菌种保藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心；）本实验室分离鉴定保存菌种：jyg1、jyg2、yz-17、yz-34、yz-42、yz-49、yz-56、xg-9、xb-2、tq1、tq2、sf-37、sf-46、sf-54、sf-56、56a、mp0070、s4、s6；人表皮葡萄球菌：975、987、999、s09099；溶血葡萄球菌：946；产色葡萄球菌：s10165；琥珀葡萄球菌：s07117；模仿葡萄球菌：s09053； 其它类型细菌标准菌种副伤寒沙门菌：atcc 50073、肠炎沙门菌：atcc 13073；大肠杆菌：atcc 25922、无乳链球菌：baa61；（本实验室购自美国菌种保藏中心）；本实验室分离鉴定保存菌种沙门氏菌：s10177；肺炎克雷伯：k10170；肠球菌：29；大肠杆菌：e10170。

重组菌液（利用嵌合裂解酶ap-lys1基因与pet32a原核表达载体合成重组表达质粒pet32a-ap-lys1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌top感受态细胞中，涂布含有50μg/ml氨苄抗生素lb平板上，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37 ℃培养过夜，获得重组菌）。

3.1.2试剂his亲和层析镍柱（ge healthcare, sweden）、pmb去内毒素层析柱、内毒素含量检测试剂盒（购自 gen script 公司）。

4. 研究创新点

4.特色或创新之处4.1噬菌体裂解酶是一种新兴的能够替代抗生素的抗菌制剂，可以解决抗生素滥用所带来的细菌耐药性问题。

4.2该裂解酶对葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染具有显著的防治效果，可以特异性的灭活金葡菌，并能为工业化生产抗菌制剂提供原料来源。

4.3该裂解酶结合裂解酶及抗菌肽的优点，针对细菌细胞壁及细胞膜作为靶标进行杀菌，同时减小两者的劣势，将抗菌肽嵌合于葡萄球菌噬菌体裂解酶，用于防治多种葡萄球菌，该抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染，特别是对于奶牛养殖场中由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染，具有良好的防治表现，且安全无毒无副作用。

5. 研究计划与进展

5.研究计划及预期进展5.1研究计划2017年12月2018年1月：进行实验室基本操作的熟悉及学习，对相关菌株进行分离，培养。

2018年2月2018年3月：进行裂解酶ap-lys1的诱导表达、纯化、裂解酶蛋白的活性测定、内毒素含量的测定。

2018年4月2018年5月：细胞毒性实验、原料乳中杀灭葡萄球菌菌株的效果实验、裂解酶杀菌谱的分析、数据分析处理，论文的撰写。