PEDV感染宿主细胞差异表达基因的筛选及其在病毒致病中的作用研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，ped）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，pedv）引起的一种猪的急性高度接触性猪肠道传染病，以腹泻、呕吐和脱水为基本特征，各日龄猪均易感，新生仔猪发病最为严重。

近年来，集约化养殖场的不断发展，增加了病原接触传播的几率，同时也加大了pedv，tgev这类急性肠道传染病的传播机会，使得仔猪病死率越来越高，给养猪业带来了巨大的损失。

因此解决pedv引起的问题迫在眉睫 [1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标本次实习运用rna测序技术对pedv感染vero细胞24h后mrna的转录情况进行对比，筛选出pedv感染宿主细胞后的差异表达基因，并研究其在病毒致病中的作用，为解决pdev问题提供理论基础。

研究内容1. 通过rna-seq 探究pedv感染细胞后基因组变化。

2. 通过差异基因通路 ppi研究筛选关键差异基因。

3. 研究的方法与方案

研究方法与方案1.vero e6细胞的培养待 vero e6 细胞生长至单层细胞后，进行传代培养，传代培养方法如下：弃掉培养液，用无菌的磷酸盐缓冲液（pbs ph 7.4）洗细胞3次，加入3 ml的 0.05%胰酶，轻轻平摇细胞瓶使胰酶覆盖住单层细胞表面，进行消化，边消化边在显微镜下观察，直到细胞状态呈现分散变圆，在即将脱落时，倒掉胰酶，注意不要将细胞倒掉，向细胞瓶中加入含10%的胎牛血清的 dmem 细胞培养液20 ml，用吸管轻轻吹下细胞，将脱落的细胞混匀吸出导入到75 cm2的培养瓶中继续培养，待长满后重复上述传代方法，继续传代备用。

2． vero e6 细胞样品制备2.1 vero e6 细胞的 pedv 的感染样品的处理据报道的方法，在单层 vero e6 细胞生长至细胞瓶的 70%~80% 时，用病毒接种液（含 100 u/m l 青霉素、100 μg/m l 链霉素和 10 μg/m l 胰蛋白酶的 dmem）将pedv稀释成103 tcid50后接种细胞，在37℃，5% co2的培养箱中培养24h，然后观察细胞病变（cpe），此时，病毒感染的细胞的基本结构没有明显的变化，也不出现细胞衰落的现象，但病毒量达到高峰。

我们将病毒感染 24 h 的细胞加入triol后放入4冰箱。

4. 研究创新点

虽然目前国内外采用高通量测序方法检测动物细菌、病毒以及寄生虫病的研究很多，但是尚未发现对pedv的研究。

且目前多数是采用基因芯片技术对疾病进行研究，采用rna-seq技术的则很少。

本实验采用高通量，效率高，高准确率的rna-seq技术对pedv感染的宿主细胞基因组进行检测分析，可以为ped的发病机制提供参考。

5. 研究计划与进展

研究计划：9.13-10.13：pedv感染vero细胞，rna测序10.13-11.13： 差异基因的功能分析以及筛选11.13-12.13： 对差异基因的动态变化进行验证12.13-1.13：pedv感染vero细胞以及幼龄仔猪预期进展：对差异基因的分析找出这些差异基因主要集中的信号通路，并从中中挑选了具有有明显变化的信号通路中的差异基因进行了ppi网络分析，从中筛选出了具有高连接度的差异基因。

进一步我们还对这些差异基因在pedv感染后的vero细胞和pedv人工感染的仔猪中的动态变化进行研究。

最终找出与病毒复制高度相关的宿主基因，为具体的病毒复制机制的探索以及开发靶向药物提供理论依据。