大肠杆菌表达FliC蛋白的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

佐剂是指一种能添加和增强免疫应答的物质，其本身毒性较小或能够延长免疫力的小颗粒分子，复合物及大分子结合物^[1-2]。佐剂的使用，能够提高、维持、引导疫苗的免疫原性，有效调节适宜的免疫反应类型，减少抗原用量并提高疫苗效率^[3]。

沙门氏菌的鞭毛是一种由11条鞭毛纤维组成的多聚体，可分为基体部、钩状部和丝状部三个部分，其中丝状部是鞭毛的主体。toll样受体(toll-likereceptors,tlrs)属于跨膜蛋白家族，tlrs系统在多种动植物中具有同源性且其具有进化的保守性，tlrs由膜外富含亮氨酸重复区、跨膜区和toll/il-1 (tir)受体同源区三个部分组成。tlrs 主要表达于免疫细胞表面，如：巨噬细胞和树突状细胞，tlrs可辅助这些apcs的成熟；tlrs也可表达于一些非免疫细胞表面，如上皮细胞。tlrs作为一种模式识别受体（pattern-recognitionreceptors,prrs），可识别病原微生物高度保守的结构基序，即所谓的病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns, pamps），并诱导产生天然免疫应答能识别病原相关分子模式，诱导先天性免疫反应^[4]。

目前对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白作为佐剂的研究较热，如makvandi m等的实验结果表明，将大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的flic，将其克隆到pet-28a载体中，成功地将重组的pet-28a-flic质粒转化为大肠杆菌bl-21（de3）。最后，用实时聚合酶链反应（pcr）证实了其能增加促炎性mrna的表达能力来评估鞭毛蛋白的功能特征^[5]。目前鞭毛蛋白主要以融合或可溶的形式来研发新型的疫苗。如奇异变形杆菌^[6]，流感抗原亚单位疫苗^[7]，肺炎链球菌^[8]，金黄色葡萄球菌^[9]，人轮状病毒^[10]，狂犬病病毒^[11]，猪繁殖与呼吸综合征病毒^[12]，艾美尔球虫等^[13]。很多的研究都证实了鞭毛蛋白在新型疫苗中，都起到了有效的佐剂作用。

2. 研究的基本内容和问题

1.1研究目标

通过大肠杆菌表达系统进行表达鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic蛋白，并进行优化表达条件，最后纯化蛋白以获取高纯度的鞭毛蛋白，为其他研究鞭毛蛋白佐剂效果奠定实验基础。

1.2研究内容

3. 研究的方法与方案

2.1研究方法

1)优化鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic的基因，将其克隆到载体pet-32a中，转化于大肠杆菌jm109中进行大量扩增质粒。

2)将上述扩增的菌液做菌液pcr进行鉴定，抽提阳性菌液中的质粒。将提取的质粒再进行双酶切鉴定该重组体系是否连接正确。

4. 研究创新点

1)鞭毛蛋白flic基因的优化。

2)优化的鞭毛蛋白表达的条件，以获取纯度更高的蛋白。

3)表达的鞭毛蛋白flic应该是大部分已可溶形式存在。

5. 研究计划与进展

1)2018年9 月——2018年10 月 查阅相关文献，着手进行本课题相关方面基础知识的学习和积累，熟悉和学习常用及相关的实验操作方法，同时进行感受态细胞的制备，获取目的基因flic。

2)2018年10 月——2018年11月 将含有目的基因的载体成功转化于大肠杆菌。

3)2018年11月——2018年12 月 将目标蛋白进行少量诱导表达。经sds-page和western blot双重鉴定目的蛋白。如成功获取目的蛋白后，则继续优化诱导条件；否则重新连接质粒和重新转化含有目的基因的质粒。