鹅星状病毒的分离鉴定及其在雏鹅体内的排毒情况开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

星状病毒（astrovirus，astv）是引起幼儿急性病毒性肠炎的重要病毒之一。appleton和higgins于1975年利用电镜检测胃肠炎患儿时首次发现该病毒的存在 addin ne.ref.{a2669fe7-c26e-4f53-b8cf-97ee9a9ff43a}^[1]。2012年国际病毒分类委员会（the international committee on taxonomy of viruses,ictv）最新分类报告指出：星状病毒科（astroviridae）分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属 addin ne.ref.{2105a94a-90b7-464f-a50a-43d4c4fa7025}^[2]。研究表明，禽星状病毒属主要感染鸡、鸭和火鸡 addin ne.ref.{1cc67634-b08e-4760-9ed5-a08d6c8f6ff8}^[3]，但自2017年以来，我国多个鹅场暴发了以痛风为特征的传染性疾病，该病主要发生于5 ~ 20日龄的雏鹅，患鹅的内脏器官及关节腔内出现严重的尿酸盐沉积，死亡率可达50%，给鹅的养殖业造成巨大的经济损失。刘宁等人的研究指出，病毒感染的爆发可能与星状病毒感染密切相关 addin ne.ref.{9fc68fed-f788-4084-8ab1-198d53a9c6f5}^[4]；姜晓宁等的研究结果表明，导致雏鹅痛风病的病原为新型鹅星状病毒 addin ne.ref.{9bfad0cb-cddc-4af2-88c0-6a9497a32ab9}^[5]；徐荣等从患病雏鹅中分离出的ahl22017毒株与其它禽星状病毒具有较低的同源性，该毒株可在鹅胚及其肾脏上皮细胞中复制，经过动物实验，表明该病毒能引起血清中尿酸盐水平升高和肾脏尿酸盐沉积，说明新型鹅星状病毒是引起临床病例中观察到的导致雏鹅发生痛风的病原 addin ne.ref.{056b9ebd-707c-455d-a970-a752fe8ccd85}^[6]，进一步证明了雏鹅痛风病的病原为新型的鹅星状病毒(gooseastrovirus.goastv)。

astv为球形、无包膜的单股正链rna病毒，病毒颗粒直径约28 nm，部分病毒颗粒具有特征性的5 ~ 6个角，外观呈星型，因而得名为星状病毒 addinne.ref.{8c1f8d0e-c277-49a0-83e9-10b5daff90f2}^[7]。病毒基因组长度约为6.8 kb，基因组从5’端到3’端顺序中包括一个约85个核苷酸的s非编码区（5 nor-aoding regionncr）、三个开放读码框架（orfla，orf1b，orf2）、一个约80个核苷酸的3’非编码区和一个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。orfla和orf1b有71个核苷酸的重叠区，orf1b的s端缺乏适合的起始密码aud，病毒基因组的3’末端具有高度保守的核酸序列（主要包括3’非编码区），1型和2型间3’非编码区保守性为94%。orf1a和orf1b编码非结构蛋白：orf1a编码一个丝氨酸蛋白酶，在丝氨酸蛋白酶编码区的下游存在一个核定位信号 addinne.ref.{04054da7-fdf8-4f6c-8750-c99eecc608d2}^[8]。星状病毒1型a2/88 newcasle株的核定位信号由2081-2131碱基编码，并且这一信号的编码区序列在各血清型间是保守的，但这一信号的作用是否提示星状病毒的非结构蛋白发生核转运则不十分清楚 addinne.ref.{f751783f-78df-46f9-a74e-a2f89ba82a56}^[9]。orf1b编码rna依赖的rna聚合酶（rna-dependent rna pdynerse，rdrp） addinne.ref.{99c497f2-179c-4dc6-b855-b99d945854dd}^[10]。

yang等对发生在我国的此轮疫情进行了流行病学系统调查和病原分离鉴定，对该病的病原进行了相关研究和基因组测序，结果发现，从患鹅中分离出的astvsdpy株与禽类星状病毒密切的相关 addinne.ref.{0ed2df20-7107-41fa-9967-c9f328a9d3ca}^[16]。刘宁等人从湖南省一家商业鹅场分离到一株astv病毒株flx，通过rt-pcr检测及遗传序列分析，证明分离到的flx毒株为新的物种 addinne.ref.{c0ebf6fc-e8db-4787-953b-4ca9b40c7e4e}^[17]。姜晓宁等人通过pcr检测、序列测定与分析以及动物回归等试验，确定了该病的病原为astv（命astv/sdpy/goose/1116/17株），他们发现1日龄雏鹅人工感染sd-py株感染雏鹅于第2天即开始出现死亡病例，且死亡数量持续升高，直至攻毒后第7 ~ 10天时死亡数达到高峰，感染第10天后死亡数量略有减少。死亡雏鹅的病理剖检结果显示，心脏、肝脏、肺脏、肾脏甚至整个内脏器官均有尿酸盐沉积 addinne.ref.{9512ee01-41c2-4929-a7e8-04010e8f341e}^[5]。然而，到目前为止尚未发现有关新型星状病毒在雏鹅体内的排毒情况及分布规律的研究。本研究拟在前人研究工作基础上 addinne.ref.{b91a3bf0-07bf-4cc5-be09-9ae493d74740}^{[5, 14,18, 19]}，利用pcr检测技术，通过采取疑似astv感染所致鹅痛风症死亡雏鹅脏器组织，制备组织悬液后经绒毛膜尿囊腔接种，利用盲传5代分离到的病毒进行人工感染试验，系统观察和研究星状病毒在雏鹅体内的分布规律及排毒情况，为研究astv引起雏鹅痛风的发病机理及其病理变化特征提供理论和实验依据。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

通过对星状病毒ah株的增殖分离、鉴定及相应的人工感染动物试验，观察和研究攻毒后病毒在雏鹅体内的分布规律和排毒情况，为研究astv引起雏鹅痛风的发病机制和病理变化特征提供理论和实验依据。

研究内容

3. 研究的方法与方案

（1）病毒扩增及鉴定

取ah株阳性病毒原液无菌接种于13日龄鹅胚37℃温箱培养，每天照胚2次，孵育7天，尿囊液继续盲传9代，回收尿囊液用于保存待用和pcr鉴定。技术路线如下：见附件

（2）动物回归试验

4. 研究创新点

（1）本项目引入试剂盒核酸提取法，保证PCR的需要量。

（2）本项目研究对象为最新发现且对养殖业造成巨大损失的病毒。

5. 研究计划与进展

研究计划

（1）2018.9.18 ～2018.10.30，体外增殖并分离、纯化、鉴定毒株。

（2）2018.10.30～2018.11.20，对1日龄易感雏鹅进行攻毒和排毒试验。