Nanos3基因在绵羊睾丸组织中的表达和定位研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题的意义

绵羊，ovis aries (linnaeus, 1758)，牛科绵羊属的一种常见的饲养动物，具有性情温顺，合群性强；喜干燥清洁，抗寒而怕炎热潮湿；嗅觉灵敏，采食力强；适应性强等优良性状。绵羊还具有肉质鲜嫩、营养价值高、羊毛可制作毛衣等经济价值，绵羊是季节性繁殖动物，在全世界各地均有饲养，中国饲养最多的在青海、内蒙古等地。生殖细胞来源于多能性干细胞，保证了大多数多细胞物种中新生组织的形成和新生命的发生。揭示生殖细胞发育的精确分子机制，是生命科学中最重要的任务和挑战之一[1]，对物种延续有重要作用。nanos 基因是编码转录抑制因子,在时空上的表达调控对于个体发育起着重要作用。nanos基因对早期胚胎发育具有重要意义，在不同物种个体形态的形成以及性腺的形成这两个非常重要的过程里，作为一个必不可少的因素，对生殖系统的发育成长和成熟起着重要作用。本文介绍了nanos基因家族在绵羊生殖细胞中的形成机制与功能表达，揭示nanos基因家族在绵羊睾丸发育中的作用，为绵羊繁殖提供理论依据。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标

探讨nanos3基因在绵羊睾丸发育过程中的表达水平变化规律及其在绵羊睾丸组织中的定位，为提高公羊的繁殖能力提供理论依据。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法

1.实时荧光定量PCR

2.WesternBlot

3.生物信息学分析

4.免疫组化试验

二、技术路线

见附件图片

三、实验方法

1.组织水平检测

1.1获取组织

屠宰绵羊，取心脏、肝脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、附睾头、附睾体、附睾尾、睾丸等组织，置于含有 RNAlater 的冻存管中，并在液氮快速冷冻，置于 -80 ℃保存备用。

1.2各组织总 RNA 的提取

（1）从 RNAlater 中取出组织，称取各个组织的重量大小约 0.1 g，置于 2 mL 的EP管中，加入 1 mL 的 Trizol 试剂匀浆，颠倒混匀，4℃静止 10 min 。

（2）加入 1/5 体积的氯仿（200mL），用力上下摇 15 s 左右充分混匀至乳白色，冰上静止 5 min 后，4 ℃，12000 rpm 离心 15 min 。

（3）小心用移液枪移取上清至另一 1.5 mL 的 EP 管。加入等体积的异丙醇上下颠倒至混匀，室温静止 10 min ； 4℃ ， 12000 rpm 离心 10 min。

（4）小心倒掉上清液，留取白色沉淀物，沿EP管壁缓慢加入 1 mL75 的乙醇（DEPC 水稀释），轻轻上下颠倒，洗涤 EP 管壁。4℃，12000 rpm 离心 5 min 。缓慢倒掉上清，在用移液枪小心吸走EP管底溶液，不要吸走沉淀。

（5）风干 10 min 。根据 RNA 的量加入 30～100 μL无 RNase 水溶解 RNA 沉淀，反复吹打至 RNA 完全溶解。

1.3RNA 浓度和纯度检测

（1）RNA 均一性检测：分别取各组织总 RNA 1 μL，利用微量分光光度计分别测定RNA 的浓度和吸光度值， OD260/OD280 的比值在 1.8 和 2.2 之间的 RNA 符合后续试验要求。

（2）RNA 完整性检测：用 1.5 的琼脂糖凝胶，总 RNA 2 L 10× 上样缓冲液 6 L电泳。凝胶成像系统分析电泳条带。

1.4RNA 的反转录

用Takara反转录试剂盒分两步法对 RNA 进行反转录。反应液的配置在冰上进行。在反应体系中根据 RNA 的浓度来确定加入 RNA 的体积大小，使总 RNA 的量保持一致。各反应体系见表 1 和 2 。

表1去除基因组DNA反应

反应条件如下：42℃2 min ； 4℃ 。

表2 cDNA的合成

反应条件如下： 37 ℃ 15 min ； 85 ℃ 5 sec ； 4℃ 。然后产物置于 -20 ℃长期保存。

1.5PCR 反应

利用普通 PCR 鉴定定量引物是否符合试验要求。根据 TaKaRa 公司 Premix LA Taq试剂说明书，按以下体系配置（见表3）。

表3 PCR反应体系

反应条件如下： 95 ℃ 5 min ； 98 ℃ 10 sec ， 60 ℃ 30 sec ， 72 ℃ 1 min ，40 个循环； 72 ℃ 5min ； 4℃ 保存。将 PCR 产物用 1 的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.实时荧光定量 PCR 检测

2.1 细胞总 RNA 提取

使用 Trizol 法进行细胞 RNA 提取与反转录，提取方法如下：

DPBS 洗细胞三次，后加 1 ml Trizol 进行消化、裂解，剩余步骤与组织 RNA 提取步骤一致。

2.2RNA 的浓度和纯度检测

检测方法同上

2.3RNA 反转录

方法同上

2.4 实时荧光定量 PCR 检测

利用 NCBI 数据库，结合引物设计软件 Primer Premier 6.0 进行相关基因引物设计，并由南京擎科生物技术有限公司合成。

实时荧光定量 PCR 检测方法如表 4 ：

表4 实时荧光定量PCR反应体系

反应条件如下： 50 ℃ 2 min ；95 ℃ 10 min ；95℃ 15 sec ，60 ℃ 30 sec ，72℃ 30sec ， 40 个循环。最后进行一次融解曲线分析：从 65 ℃ 上升到 95 ℃ ，每 0.2 ℃ 记录一次。

3. Western Blot

（1）蛋白提取：取黄豆大小的组织，加入0.2mL裂解液，使用电动匀浆仪器匀浆，使组织充分裂解；冰浴10min，4℃，1200转离心10分钟，取上清液保存于-80℃低温冰箱。检测浓度。

（2）蛋白变性：根据检测得到的蛋白浓度，加入适量裂解液和20 μL 5×上样缓冲液，将蛋白终浓度调节至2 μg/μL，吹打混匀，100℃变性10 min。

（3）电泳：缓慢拔出梳子，分别加入10 μL蛋白Marker和10 μL变性蛋白样品， 80 V，电泳30 min，再改变电压至120 V，电泳90 min，当溴酚蓝到达玻璃板底部时结束电泳；

（4）转膜：根据目的蛋白大小和蛋白Marker指示，切割分离胶，并剪好对应大小的PVDF膜，甲醇激活2 min。从下到上按照纤维垫、滤纸、胶块、PVDF膜、滤纸、纤维垫的顺序叠放，排除各层之间的气泡，夹好板夹。加入预冷的转膜液，电压60 V，冰浴转膜90 min；

（5）封闭：将PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入5 BSA，室温封闭2 h；

（6）一抗孵育：吸除5 BSA，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜；

（7）二抗孵育：TBST洗5次，每次3 min，加入稀释好的二抗，室温孵育1 h 30 min；

（8）ECL显影：TBST洗5次，每次3 min。将PVDF膜放入ECL显影液A液和B液等体积混合液中1min，生物发光成像仪中曝光拍照；

（9）灰度分析：利用Image J软件分析目的蛋白和内参条带的灰度值。

4. 免疫组化

（1）石蜡包埋好的组织制作成5μm的切片，烘干烤片，使用二甲苯脱蜡，并使用梯度酒精水化，一部分用于HE染色（使用HE染色试剂盒），一部分用于免疫组化实验；

（2）柠檬酸钠溶液20mL和PBS 180mL对玻片进行热修复；

（3）热修复后PBS洗3次，甲醇 双氧水除去内源性过氧化物酶，PBS洗净，封闭1.5h；

（4）按照抗体推荐说明书稀释，一抗4℃孵育12h；

（5）PBS洗净，二抗孵育，避光，室温1h

（6）PBS洗净，DAB显色（棕黄色）后PBS冲洗，苏木精染色。

（7）染色后重新二甲苯处理，并树脂 二甲苯封片，40倍光学显微镜观察拍照

四、可行性分析

本实验所需要的湖羊公羊由江苏省泰州市海伦羊业有限公司提供，文献资料可以从中国知网、NCBI 查询，数据库和分析软件都是可以从各网站获取，实验仪器（包括超净工作台、微量分光光度仪器、CO2 培养箱、液氮罐、倒置显微镜等）由实验室中提供，所需实验试剂可以通过购买得到。本人经过SRT学习和锻炼已掌握一定的实验操作技能，研究方法具有合理性，从理论来说具有可行性。

4. 研究创新点

系统分析了睾丸发育各阶段Nanos基因家族表达的动态变化，探究了其在睾丸发育中的作用。

5. 研究计划与进展

1. 2018 年 07 月：实验技术学习；

2. 2018 年 08 月- 2018 年 10 月：饲养及采集样本；

3. 2018 年 11 月- 2019 年 02 月：试验样品的采集和处理；