1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 项目意义：桔梗(Platycodongrandiforus (Jacq.)A.Dc.)作为桔梗科 (Campanulaceae)植物，其根可以入药，具有祛痰止咳、宣肺、排脓作用，用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽喉肿痛、肺痈咳吐脓痰等症[1]。其嫩茎叶和根均可供蔬食。我国大部分省区均有分布，在东亚、前苏联远东地区、朝鲜半岛、日本列岛也有分布[2]。桔梗的主要含桔梗皂苷D、菊糖、桔梗聚糖、葡萄糖及植物甾醇等成分，具有抗炎、祛痰、镇咳、抗溃疡、降血压、扩张血管、解热镇痛镇静、降血糖、抗胆碱、促进胆酸分泌、抗过敏及增强人体免疫力等广泛的药理作用[3]。近年来，对桔梗的研究主要集中在化学成分、药理作用、有效成分的提取等方面，对栽培技术基础研究相对欠缺。 氮是植物重要的营养元素，植物体吸收的氮素形态主要有无机态氮（硝态氮和铵态氮）、有机态氮如尿素等，各种形态氮吸收利用的形式是不同的，但进入植物体后，最终都要以同样的方式经过谷氨酸或谷氨酰胺的转氮作用形成不同的氨基酸，进而合成蛋白质。氮素的吸收和同化与植物的很多生理过程（如光合作用、光呼吸等）、产量和品质关系密切[4]。桔梗既具有中药价值，但多数作为蔬菜食用，尤其在东北地区有悠久食用历史，在韩国更作为一种重要蔬菜，作为蔬菜安全，亚硝酸盐积累已被广泛关注，硝酸盐在蔬菜中的积累，取决于根、茎、叶对它的吸收与输送过程及对硝态氮（NO3--N）的同化作用[5] 。本项目采用2种不同形态氮处理，探索桔梗对氮素营养吸收，以及亚硝酸盐积累规律，具有实际应用价值。 国内外研究概况：不同形态氮素处理对药用植物活性成分的影响不同。但氮素对桔梗的影响研究较少，在对其他药用植物研究中，孙世芹等(2008)研究表明，一定比例的NH4 -N有利于喜树碱的合成和积累；当NH4 -N超过50%时，喜树碱的含量反而明显低于以NO3--N为单一形态氮素处理的；当NH4 -N/NO3--N为25:75时最有利于喜树碱在幼苗中的合成和积累[6]。罗永明(2006)在研究不同氮源对鸡骨草药材质量影响中发现，盆栽试验中，施用NaNO3和CO(NH2)2有利于黄酮的积累[7]。李灿雯（2012）研究表明，氮素配比施用较单一形态氮素有利于半夏植株的生长，较高比例的硝态氮有利于生物碱的积累，较高比例的铵态氮有利于有机酸的累积[8]。晏枫霞（2010）研究表明，菘蓝生物量随铵硝比的降低先增加后下降；提高NH4 -N的比例，有利于菘蓝叶片靛玉红和根中多糖的积累[9]。 氮素形态影响了植物的氮素代谢、光合作用、呼吸代谢等，而这些生理代谢的最终表现形式是植物形态和产量，所以铵态氮和硝态氮也影响了植物形态和生长。首先，不同氮素形态影响了植物的外部形态。较大量硝态氮可以促进施用硝态氮部位侧根的发生[10]，且使根系长度增加；Marcus [11]分根试验也支持了上述结论，同时证明铵态氮也能促进侧根的形成，但使根系明显变短、加粗。其次，氮素形态对植物生长发育的影响因植物不同而异。赵姣姣（2013）的研究表明，在硝铵比为1:4时，桔梗根鲜重和根冠比最高[12]。 |
目前，我国对各种药用植物的栽培加工技术方面的研究日益深入，而我国对桔梗栽培加工技术方面还只是出于初级阶段。矿质元素和药用植物中有机活性成分的形成密切相关[13]；药用植物中适量的矿质元素如Ca、Fe、Cu、Mn、Zn能够加强人体免疫系统以及其它系统的功能。相反地，人体矿质元素缺乏会引起各种疾病，或者矿质元素过量会引起金属中毒[14]。相比其他药用植物，如不同条件下蔬菜中亚硝酸盐含量的变化[15]，施肥对蔬菜累积硝酸盐影响的研究进展[16]，蔬菜积累的硝酸盐及其对人体健康的影响[17]等，都已有了较为深入的研究与结果。而关于两种不同形态氮对桔梗的生长影响及桔梗皂苷的影响的研究则无例可举。本项研究拟在可以找出最适桔梗生长的两种形态氮的比例，以期为桔梗标准化栽培种植提供理论依据。 应用前景：通过此项目的研究，可以确定两种形态氮的最合适施用比例，既可以保障桔梗的药用质量，亦可以保障其食用质量，在保障其药效的前提下，其积累的硝酸盐含量不会对人体造成损害。因为氮肥是影响硝酸盐累积的最主要因素之一。硝酸盐积累量随氮肥用量的增加而增加，施氮导致了硝酸盐的成倍增长，偏施和滥施氮肥是造成蔬菜品质恶化的重要原因。但两种不同形态氮的施用比例不同，其桔梗硝酸盐积累量不同。本项目就是为了探究既保证桔梗生产及产品质量，又能使桔梗硝酸盐含量相对较低的两种形态氮比例，为桔梗的标准化、规范化栽培提供理论依据。 参考文献： [1]中华人民共和国药典委员会,中华人民共和国药典（2000年版一部）[M]. 北京,化学工业出版社,2000,225-226. [2]周荣汉.中药资源学[M]. 北京, 中国医药科技出版社,1993,486-489. [3] 舒娈,高山林.桔梗研究进展[J]. 中国野生植物资源,2001,20（2）:4-6. [4]刘秀杰,宫占元.植物氮素吸收利用研究进展[J].现代化农业,2012,8(1):20-22. [5] 刘永刚,陈利军,武志杰.蔬菜中硝酸盐的积累机制及其调控措施[J].土壤通报, 2006, 37 (3): 612-616. [6]孙世芹,阎秀峰.氮素形态对喜树幼苗喜树碱含量及喜树碱代谢相关酶类的影响[J].中国中药杂志,2008,33 (13): 1519-1521. [7]罗永明.氮源对鸡骨草生长和药材质量影响的研究[D].广西大学,2006. [8]李灿雯,王康才,等. 氮素形态对半夏生长及生物碱和总有机酸累积的影响[J].植物营养与肥料学报2012,18( 1) : 256-260. [9]晏枫霞,王康才,唐晓清,等.氮素形态对菘蓝活性成分和矿质元素含量的影响[J].江苏农业学报，2010,26(4): 735-739. [10]Bhat KK S. Nutrient inflows intoapply roots[J]. Plant Soil,1983,(71 ): 371-380. [11]Marcus S,Boy F,Peter S. Rootmorphology and nitrogen uptake of maize simultaneously supplies with ammoniumand nitrate in a split-root system[J]. Annals of botany,1993,72: 107-115. [12]赵姣姣,刘文科,杨其长.氮素水平和形态对基质栽培桔梗生长及生理参数的影响[J].北方园艺,2013（04）:162-165. [13]Kolasani A,Xu H,Millikan M 2011.Evaluation of mineral content of Chinese medicinal herbs used to improvekidney function with cheinoinetrics. Food Chemistry,127: 1465-1471. |
[14]Lee K J,Hwang S J,Choi J H,Jeong H G.2008. Saponins derived from the roots of Platycodon grandiflorum inhibitHT-1080 cell invasion and MMPs activities: Regulation ofNF-kB activation viaROS signal pathway. Cancer Letters,268: 233-243. [15]陈利梅,李德茂,曾庆华.不同条件下蔬菜中亚硝酸盐含量的变化[J].食品与机械,2009,25（3）:102-105. [16]熊国华,林咸永,章永松.施肥对蔬菜累积硝酸盐影响的研究进展[J].土壤通报,2004,35（2）:217-220. [17]都韶婷,章永松,林咸永.蔬菜积累的硝酸盐及其对人体健康的影响[J].中国农业科学,2007,40（9）:2007-2014 |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：（1）了解两种不同形态氮对桔梗生长的影响
（2）了解不同形态氮对桔梗产品质量的影响。
研究内容:（1）研究两种不同形态氮对桔梗的生长状态的影响。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法及实验方案 1 试验材料 试验繁殖材料为桔梗一年生幼苗。栽培基质为蛭石。基本营养液配方采用Hogland营养液配方。 2 试验设计 将一年生桔梗栽入盆中，每盆10 株，共 50 盆。采用不同铵硝配比单因素完全随机处理，在基本营养液的基础上，总氮量一致（N浓度为14 mmolL-1）的条件下，设计 5 个不同水平的铵硝比例（(NH4 -N/NO3--N），分别是100:0，75:25，50:50，25:75和0:100，其中 NH4 -N 由 (NH4)2S04 提供，NO3--N 由 Ca(N03)2 提供，各处理重复5次。处理每 10 天一次。测桔梗生长指标，生理生化指标，质量指标。 3 测定项目与方法 3.1 生长指标 桔梗生长1个月后，每个处理随机采集 5 株，洗净，测量其茎长、叶长、根长，称量植株地上部分和地下部分的鲜重，105 ℃ 杀青1 min，于60 ℃ 烘干至恒重后，称量其干重。 3.2 生理生化指标 3.2.1叶绿素测定 取新鲜植物叶片或干材料，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。 称取剪碎的新鲜样品0.2 g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及95%乙醇2~3 ml，研磨成匀浆，再加95%乙醇10 ml，继续研磨至组织变白，静置3~5 min。 取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25 ml棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵，研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25 ml，摇匀。 把叶绿体色素提取液倒入光径1 cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长665 nm、649 nm、470 nm下测定吸光度。 3.2.2蛋白质、可溶性糖含量测定 取0.3 g 新鲜叶片，加入10 ml 蒸馏水研磨成匀浆，4000 r/min 离心20 min，弃沉淀，取上清液转入10 ml容量瓶，用蒸馏水定容，即为样品提取液。 蛋白质：样品提取液0.1 ml，加入5 ml考马斯亮蓝，在595 nm 处测定吸光值（以空白为对照） 可溶性糖：将剩余样品提取液煮沸后4000 r/min离心15 min，取上清液0.1 ml，加入1.9 ml蒸馏水，0.5 ml 蒽酮乙酸乙酯和5 ml 浓硫酸，在630 nm 处测定吸光值（以空白为对照） 3.2.3光合参数的测定 选取由里至外全展的第二轮功能叶片中部作为测定部位。用LI-6400型光合仪于1 000光子强度下测定净光合速率（Pn)、气孔导度 (Gs) 、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率(Tr)，每处理测定5次，取平均值。 | ||
3.2.4硝态氮和铵态氮含量的测定 3.2.4.1硝态氮含量 吸取500 gml-1 NO3N标准溶液 1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml、12 ml分别放入50 ml 容量瓶中，用去离子水定容至刻度，使之成为10、20、40、60、80、100、120 gml-1 NO3N的系列标准溶液。 吸取上述标准溶液0.1 ml ，分别放入刻度试管中，以0.1 ml 去离子水代替标准溶液做空白，再分别加入0.4 ml 5% 水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20 min 后，再加入 8% NaOH溶液9.5 ml ，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10 ml。 以空白作对比，在410 nm下测定吸光度，制作标准曲线并计算回归方程。 取一定量的样品剪碎混匀，精确称取2~3 g 3 份，分别放入 3 支刻度试管中，加入10 ml 去离子水，用玻璃珠封口，置入沸水浴中提取 30 min ，用自来水冷却，将提取液过滤到25 ml 容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。 吸取样品液0.1 ml 分别于3支刻度试管中，然后加入5 % 水杨酸-硫酸溶液0.4 ml，混匀后置室温下20 min ，再慢慢加入9.5 ml 8 % NaOH溶液，待冷却至室温后，用空白做对比，在410 nm 处测定吸光度，计算NO3N含量。 3.2.4.2铵态氮含量 取新鲜样品，洗涤，擦干并剪碎，混匀后，迅速称取0.5~1.0 g，于研钵中加入5 ml 10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100 ml。混匀，并用于滤纸过滤三角瓶中备用。 制作标准曲线：按下表加入试剂后，置沸水中加热15 min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20 ml，混匀后用1 cm光径比色皿在570波长下测定吸光值，以氨基酸毫克数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出其直线回归方程。
样品测定：吸取样品滤液1.0 ml，放入20 ml干燥试管中，再加入无氨蒸馏水1.0 ml，接着加入0.5 ml乙酸-氰酸盐缓冲溶液和3.0 ml水合茚三酮，然后按标准曲线制作步骤显色、比色，根据样品吸光度在标准曲线上查得或用回归方程计算出样品滤液中的含氮量。 | ||
3.2.5硝酸还原酶活力的测定 标准曲线的制作：取7支洁净烘干的15 ml 刻度试管按表1顺序加入试剂，配成0~2.0 g 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25 ℃ 下保温30 min，然后在540 nm 下比色测定。以亚硝态氮为横坐标，吸光度值为纵坐标建立回归方程。
酶的提取：称取0.5 g 鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30 min，取出置冰浴中加少量石英砂及4 ml提取缓冲液，研磨匀浆，转入离心管中在4 ℃、4000 r/min 下离心15 min，上清液即为酶粗提取液。 酶的反应：取粗提取液0.4 ml 于10 ml 试管中，加入1.2 ml 0.1 mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4 ml NADH溶液，混匀，在25 ℃水浴中保温30 min，对照不加NADH溶液，而以 0.4 ml 0.1 mol/L pH 7.5 的缓冲溶液代替。 终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1 ml 磺胺溶液终止酶反应，再加入1 ml 萘基乙烯胺溶液，显色15 min 后于4000 r/min 下离心15 min ，取上清液在540 nm下比色测定。根据回归方程计算亚硝态氮总量。 4 质量评价 桔梗皂苷D测定方法 精密称取干燥至恒重的桔梗皂苷D对照品，加甲醇溶解，配成0.4 mg/mL，作为对照品溶液。 分别精密吸取对照品溶液2，5，10，15，20，25，30 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。 精密称取本品粉末4 g，以甲醇25 mL超声提取30 min，过滤，回收甲醇，浸膏加水以乙醚脱脂，水液以水饱和的正丁醇提取，提取液蒸干，以甲醇定容至10 mL。用0.45 μm滤膜过滤后，进样10 μL，进行测定。 以色谱峰面积和标准曲线计算桔梗皂苷D含量。 |
可行性分析:
（1）试验材料、实验室条件、仪器设备、试剂等客观条件
中药教学实验中心的栽培实验室设施完备，通过栽培及对各组实验苗按比例喷施不同形态氮素溶液来获取本实验需要的桔梗各生长阶段根；培养皿、高液相色谱仪、总氮测定仪等必备的仪器设施齐全；各类药品、试剂均可直接从实验室获取。
（2）主观条件：
本人是中药专业学生，又学过无机化学、有机化学、生物化学以及植物生理学等课程，有一定的理论基础支撑；同时也做过相关的课程实验，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，因此准备工作相当充足。
综上所述，本实验可行。
4. 研究创新点
目前，桔梗种植较为广泛，不仅可做药用，还可作为食材。但是桔梗研究多集中在桔梗成分、药理等方面，在栽培方面，氮肥对桔梗影响的研究较少。本项目通过分析喷施不同形态氮后，桔梗叶中硝酸盐含量以及根中蛋白质、皂苷D的含量变化，来研究不同形态氮对桔梗生长、产量和品质的影响，不仅可为桔梗的扩大生产及提高药用质量提供理论依据，在食品安全方面也有重大意义。
5. 研究计划与进展
本研究预期在12个月内完成：2014年3月2015年5月
2014.32014.4 ：进行前期工作，查找文献资料，完成研究方案的设计。
2014.42014.6 ：种植桔梗，按不同比例根外喷施不同形态的氮溶液
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