免耕覆秸耕作制度下黄淮海大豆田土壤病原真菌的调查开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

农作物秸秆是农田土壤有机质的重要来源。秸秆中含有农作物生长所需要的氮、磷、钾、镁、钙和硫等营养元素，可以作为农业生产中重要的肥料资源[1]。还田不仅是回收利用秸秆的一种重要方式，还可以减少野外焚烧秸秆出现的浪费资源和环境污染等问题[2]。秸秆还田后在土壤中分解，能有效提高土壤有机质含量和肥料利用率，改良土壤结构和物理性状，综合改善土壤水、肥、气、热等方面的生态效益[3]。

世界农业发达国家十分重视土地的用养结合，秸秆还田和农家肥占施肥总量的2/3[4]。美国把秸秆还田当作农作制中的一项关键技术，坚持常年实施玉米、小麦等秸秆大量还田[5]。英国秸秆直接还田量则占其生产量的73%[6]。秸秆直接还田在日本被当作农业生产中的法律去执行。德国等发达国家法律规定禁止焚烧秸秆。由此看来，秸秆还田一直受到世界各国的高度重视。

我国政府也十分重视秸秆的合理利用问题，并在资金、政策等方面给予了大力扶持与推动，极大地促进了秸秆综合利用工作的广泛开展[7]。秸秆直接还田已经成为中国沃土工程和丰收计划的重要内容。

2. 研究的基本内容和问题

目标：

通过高通量测序方法彻查黄淮海大豆栽培土壤的微生物种类与丰度，并根据逐年调查的结果分析免耕覆秸对土壤病原微生物种群的影响。

内容：

主要通过研究大豆播种前、30天、60天、90天共四个时期采集的土壤样品的细菌和真菌群落结构，并结合田间发病情况，了解黄淮海大豆病害的主要病原物；通过与往年调查结果比较，分析免耕覆秸对黄淮海大豆病原物的动态变化的影响。

3. 研究的方法与方案

1. 土壤病原微生物种群调查

取样时期：大豆播种前及播种后30天、60天、90天4个时期取土样，同时记载生育时期。

取样方法：每个小区采用九点S型法，固定9点（塑料桩标记），每次在固定点周围50cm范围内使用土壤取样器（统一提供）满容取土（取土深度20cm），分别将每个小区九个点的土样混合均匀后，用四分法留取1公斤左右的土样。将土样装入干净保鲜袋，注明采集样品的背景资料后带回实验室，20℃保存用于检测。

2. 主要方法和手段

1）土壤微生物总DNA提取

称取-20C保存的新鲜土样0.25 g，采用MoBio公司的MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒按产品说明书进行提取。上机测序前，分别用酶标仪和琼脂糖凝胶电泳对样品浓度和完整性进行检测。

2）16S扩增子测序

16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的分子钟，其序列包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（Constant region）。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。将提取的土壤样品DNA用Illumina Miseq测序平台进行Pair-end测序。选取16S rDNA V4区引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对土壤微生物总DNA进行扩增。

PCR反应体系：

PCR反应条件：1) 94C 3 min；2) 94C 45 s; 3）50C 60 s; 4）72C 90 s；5）Repeat steps 2-4 35 times；6）72C 10 min；

每个样品一式三份，共75L

琼脂糖凝胶电泳，预期条带大小约300-350 bp

切胶回收

测回收浓度和OD260/OD280

3）ITS扩增子测序

ITS（Internal Transcribed Spacer）被广泛应用在真菌分类鉴定中。ITS属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。

4）LAMP检测土壤病原菌

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA 聚合酶的作用下，等温条件下，快速进行核酸扩增的方法。可以在1h内，将靶序列片段扩增109~1010 倍。具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简单等优点。

本试验用LAMP技术检测提取的土壤样品中是否含有尖镰孢菌、茄腐镰孢菌、层出镰孢菌、禾谷镰孢菌、木贼镰孢菌、立枯丝核菌、冬青丽赤壳菌、大豆疫霉菌、菜豆壳球孢菌等病原物。

HNB体系（26 μL）：

反应条件： 62℃ 80min

3. 田间调查

记载大豆播种期、出苗期、开花期、成熟期，病虫害发生情况等；记载小麦播种期、收获期、病虫害发生情况等。

4. 室内考种

大豆成熟后每小区取中间行生长正常的连续10株样进行考种，调查株高、主茎节数、有效分枝数、单株荚数、单株粒数、单株粒重、百粒重等。

5. 产量测定

4. 研究创新点

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术,具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等优点,己在核酸研究、临床诊断和转基因食品检测等领域得到了广泛的应用,成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。本次实验为了得到准确的数据需要连续几年去做实验分析数据，每年有120份样品，实验过程次数多，选用LAMP技术能够快速的进行核酸扩增，节省了人力财力。

5. 研究计划与进展

实验只进行了一年，今年送公司测序的部分数据还没有完成，预计在年后完成数据分析和结果，但是为了得到准确的数据还需要两到三年的实验。

（5个小区/块地2块地（还田类型）4个时期3个试验站=120份样品/年。

）