引起天竺葵环斑症状病毒的分子鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 课题意义和研究概况：

天竺葵属（pelargonium l' hr），植物约有300余种。野生的天竺葵原产于南部非洲，通过自然杂交和人工杂交人们选育了上千种天竺葵栽培品种。目前最为普遍栽培的花匠天竺葵就是小花天竺葵和马蹄纹天竺葵的杂交种。香叶天竺葵和芳香天竺葵是主要的观叶天竺葵。有记载的天竺葵病害77种，其中真菌病害47种，细菌病害6种，病毒病害24种。做本课题的主要原因是要确定引起天竺葵环斑症状的病毒是不是tswv（番茄斑萎病毒），所以下面要说明的是天竺葵的病毒病害及tswv（番茄斑萎病毒）的症状。

1.1天竺葵的病毒病害

2. 研究的基本内容和问题

研究目标，内容:

1,天竺葵毒源接种至本氏烟上观察其症状。

2,采集接种的发病本氏烟用tswv和insv进行elisa检测。

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案

1,野外采集的感染病毒病的天竺葵毒源接种至本氏烟上观察其症状。

2,采集接种的发病本氏烟分别用TSWV和INSV的抗体来进行ELISA检测。

3,抽取发病本氏烟的系统叶总RNA，反转为cDNA后，分别用扩增TSWV和INSV片段的引物进行片段扩增。

3.1提取RNA

组织和细胞总RNA提取（TRIzol法）：

（一） 试剂准备

1 ． TRIzol 试剂。

2 ．氯仿

3 ．异丙醇

4 ． 75% 乙醇（ DEPC H2O 配制）

5 ． DEPC H2O

（二） 操作步骤

1．样品处理：我们接种的本氏烟取出出现病状的顶部叶片，在液氮中磨碎，之后放1.5ml的离心管，加入1ml的Trizol，震荡一下，让液体混合。一下操作都在冰箱进行，不然的话mRNA很容易降解；

2.放置冰箱5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

3．4 ℃ 离心， 12000rpm 10min ，取上清，上清中含有RNA；

4．每使用1mlTrizol的加入0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15s ，冰箱里放 3min ；

5. 4 ℃ 离心， 12000rpm 15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中；

6.把水相移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相；

7.加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，冰箱静置 10min ；

8．4 ℃ 离心， 12000g 10min ，弃上清；

9．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 7500g 5min ，弃上清。 10.晾干RNA，室温放置干燥5min；

11.加入50ml的 DEPC H2O 溶解。放-65℃，不然的话RNA会降解。

注意事项

1 ．样品量和 Trizol 的加入量不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致 RNA 降解。 2 ．实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。

3.2反转录

cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。

操作过程：

1）在冰浴的0.2ml管加这下面混合液

2）轻轻混匀后，在PCR仪上进行如下操作：

65℃ 5min ，再冰浴2min

3）再加入如下：

4）轻轻混匀后，在PCR仪上进行如下操作：

42℃ 60min ，72℃ 15min

5）随即冰上冷却，得到的cDNA可以直接用于后续实验的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。

3.3采接种样系统叶进行RT-PCR(LA体系，扩增引物见表1)。

扩增引物表如下：

3.4同时，为排除与TSWV症状类似的INSV的干扰，用INSV的外壳引物扩增接种样的RNA。

4, 将以上扩增片段回收构建到T-vector pMD19载体进行测序。

4.1连接T载体：

4.2转化：

1）取50l的感受态细胞悬液，置于冰上。

2)加入链接产物5l，轻轻摇匀，冰上放置20min。

3）42℃水浴中热击50s，迅速置于冰上冷却5min。

4）加入800l无抗性LB液体培养基，混匀后37℃震荡培养50min，使细菌恢复正常生长状态。

5）震荡后离心2min，4000rpm。

6）取100l上述菌液涂布于含相关抗性的筛选平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。

4.3天竺葵TSWV菌落筛选

反应体系如下：

做菌落PCR实验步骤如下：（以下都是在冰盒上操作）。

1） 准备体系相关的反应物放在冰盒里。

2） 拿几个小离心管放在板子上，从水开始一个一个加。

3） 加菌落一定要在超净台上操作。

4） 放PCR仪，按以下条件来跑PCR。

PCR反应条件如下：

94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃ 10.0

2：00min 0:10min 0:30min 延伸时间 10:00min 保存

5,测序结果与TSWV序列比对。

技术路线：

1）接种观察典型症状拍照；

2）采样用TSWV和INSV进行ELISA检测拍照；

3）采样提取RNA反转录用扩增TSWV和INSV片段的引物进行片段扩增；

4）割胶回收链接T载体转化菌落筛选进行双向测序。

4. 研究创新点

RNA是生物体内重要的遗传物质，细菌总RNA的提取是分子生物学研究的基础。RNA提取的实质就是将细菌的细胞壁破裂后，释放出其中的RNA，并通过不同的方式去除糖类，脂类，蛋白质，DNA等杂质，从而得到高纯产物的过程。

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样 品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水相层和有机层。RNA存在于水相层中。收集上面的水相层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。

5. 研究计划与进展

整个课题研究从2015.9.12016.4.12 ；

主要分为以下五个阶段：

第一阶段（2015.9.12015.9.26）：设计实验方案，野外采集感染病毒病的天竺葵毒源, 把毒源接种至本氏烟上观察其症状；