胶状溶杆菌中第二信使c-di-GMP合成相关基因的克隆及敲除载体的构建开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

溶杆菌属于黄单胞科(xanthomonadaceae)，溶杆菌属(lysobacter)，是一类环境友好、但较难分离的有益革兰氏阴性细菌（christensen cook, 1978）。这类细菌以产生结构多样的小分子抗菌（真菌、细菌等）物质而闻名，是一类新型抗菌代谢产物的重要来源，但未完全开发的生防细菌（christensen cook, 1978； xie et al., 2012）。截止2014年，国际上报道的溶杆菌属细菌已达到22个种，包括4个典型种，即产酶溶杆菌（l. enzymogenes）、产抗生素溶杆菌（l. antibioticus）、胶状溶杆菌（l. gummosus）和变棕溶杆菌（l.brunescens）。

胶状溶杆菌oh17是本实验室从安徽水稻根际土壤中分离筛选到的一株对丝状真菌、酵母和卵菌均具有拮抗活性的菌株，具有自主知识产权。通过培养性状观察、生理生化测定以及基于16s rdna的分子生物学研究，将该菌株鉴定为胶状溶杆菌（l. gummosus）。目前，本课题组已经完成了该菌株的基因组测序，并从中鉴定了12个与次生代谢产物相关的基因簇。同时，课题组也建立了oh17的遗传操作体系，实现了基因的定向敲除和互补。利用该操作体系，课题组正在研究这些基因簇的生物学功能期望从中发现与抗菌活性以及小分子抗菌物质的生物合成相关的基因簇。

与此同时，本课题组还期望利用基因遗传调控的手段来获得抗菌活性丧失或显著下降的突变株。通过对野生型oh17和这些突变株代谢产物的化学分析，快速定位与抗菌活性相关的小分子代谢物质，进而研究它们在oh17中的生物合成机理。本人的毕业实习课题就是围绕该总体目标来设计和开展相关实验的。具体来说，本人的研究目标是探索细菌新型第二信使环二鸟苷酸（c-di-gmp）在胶状溶杆菌oh17抗菌活性发挥中的功能，主要聚焦oh17中c-di-gmp合成相关基因的克隆及敲除载体的构建。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

鉴定胶溶杆菌oh17中第二信使c-di-gmp合成相关基因，并对这些基因进行克隆，构建相应的敲除载体。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

采用pcr技术克隆胶溶杆菌中第二信使c-di-gmp合成相关基因，用同源重组的方法，构建针对每一个合成基因的敲除载体。

技术路线

4. 研究创新点

特色或创新之处

以往对c-di-GMP的研究多集中于植物和动物病原细菌中，在生防细菌中关于c-di-GMP的功能及调控机制鲜有报导，特别是在溶杆菌中，c-di-GMP的功能及对小分子抗菌物质的调控机制还未见报导。因此，揭示生防细菌--胶状溶杆菌OH17中c-di-GMP对其抗菌活性的影响将有助于鉴定新的小分子抗菌物质。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

1、2015年6月2015年7月：查阅文献

2、2015年8月2015年9月：生物信息学分析预测c-di-gmp合成相关基因