转基因棉花对不同棉铃虫种群的抗性检测开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

棉花是一种世界范围内较为重要的经济作物，在我国农作物中占有非常重要的地位，棉铃虫helicoverpa armigera（hbner）是隶属于鳞翅目（lepidoptera）夜蛾科（noctuidae）的一种世界广布性农业害虫，自20世纪90年代以来在我国连年大发生（fitt, 2003）。为控制棉铃虫对棉花的危害，人们采取了多种防治措施和方法。在1997年以前，主要依赖化学杀虫剂控制棉铃虫的危害。但由于过度依赖化学杀虫剂，棉铃虫对各类杀虫剂产生了不同程度的抗性，并对常用的化学杀虫剂，特别是菊酯类杀虫剂产生了严重的抗药性，并对我国主要棉区的棉花生产造成了重大的经济损失。自1997年以来，转bt基因抗虫棉在我国大面积推广种植，在很大程度上缓解了棉铃虫对棉花的危害，也大大减少了化学杀虫剂的使用，带来了明显的经济和生态效益（pray et al. 2001; wu and guo, 2005; wu, 2009; james, 2010; lu 等，2012; perlak et al. 2001）。然而bt作物的广泛种植可能导致靶标害虫在持续的选择压力下，对bt毒素产生抗性，并且，已经有研究显示，因田间抗性导致bt毒素对靶标生物仿效下降的现象已经在7种害虫中得到发现（tabashnik, 2003; ferre and van rie, 2002; tabashnik et al. 2011）。基因叠加策略是将两种或两种以上作用方式不同的毒素基因共同转入同一种作物，形成双价或多价抗虫作物，从而使靶标害虫对多种不同bt毒素同时产生抗性的风险大大降低（zhao等，2003）。同时表达cry1ac和cry2ab毒素蛋白的双价抗虫棉已在美国和澳大利亚被推广种植，并逐步取代第一代bt棉（haonan et al. 2011）。但目前已经有报道显示棉铃虫可以对cry1ac和cry2ab产生不对称的交互抗性（tabashnik等，2009）。an2ab抗性品系在筛选至第11代时与起始种群an相比，对cry2ab具有262倍的抗性，同时对cry1ac活化毒素具有37倍的交互抗性。继续用cry2ab筛选的an2ab品系在第20代时对cry2ab抗性升至636倍，同时对cry1ac活化毒素具有60倍的交互抗性，这对双价棉的持续使用造成了极大的威胁。为了丰富防治策略，有必要开发更新更安全的抗虫方法，寻找新的有效的抗虫基因。

rna干扰（rna interference，rnai）是外源性基因在宿主细胞内转录过程中产生的双链rna（double-stranded rna，dsrna）被核酸内切酶dicer切割成多个大约21-23 bp大小的具有特定长度和结构的小rna（small interfering rna，sirna），这些sirna能够对同源mrna进行高效降解，rnai目前被广泛应用于基因功能的研究。

rnai技术在植物的害虫防治方面也有着很好的发展。已经有报道称，利用植物表达与昆虫特定基因匹配的dsrna分子，当昆虫取食这类植物后，其靶标基因的表达明显降低，生长被抑制从而达到一定的抗虫效果( jin-qi et al. 2012)。

2. 研究的基本内容和问题

目标

通过研究不同类型的转基因棉花材料对不同的棉铃虫品系的抗性情况，结合现有的田间棉铃虫的抗性监测数据，能够对bt棉的持续使用、新型抗虫棉的研发及bt抗性的延缓起到很好的指导作用。

内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

1、ELISA方法： 测定转Bt棉花的毒素表达含量

2、棉叶生测： 通过喂食不同品种的棉铃虫不同类型的棉花叶片，研究各棉花材料的抗虫性

技术路线

测定转Bt棉花材料对敏感棉铃虫的抗性情况

2、各棉花品种的抗虫性鉴定

从田间健康的棉花植株上采取新鲜的倒三叶，放置在冰盒中直至使用。将棉叶表面的水分用吸水纸吸干并将叶柄处剪成斜面，插入倒有琼脂的大试管中。每张棉叶接种5头棉铃虫初孵幼虫，后覆盖2层黑布，防止幼虫逃逸。每10张叶片为一个重复，每个处理设3个重复。将接种好的棉铃虫置于261℃恒温，光周期（14L：10D）的光照养虫室进行观察。5天后查结果，并记录当天接种棉铃虫的死亡率、平均体重和叶片的受损情况，之后将存活幼虫转入正常饲料饲养至化蛹，并观察期间的生长发育状况。

可行性分析

本课题所涉及的实验室棉铃虫饲养技术成熟、棉叶生测等基本的研究方法稳定、经验丰富、可行性较强

4. 研究创新点

我们所选取的实验材料具有广泛的代表性，棉花材料包括国内推广使用的转Cry1Ac的抗虫棉、美国和澳大利亚已经推广使用的双价棉，以及目前研究热门的表达昆虫相关基因的dsRNA的新型转基因棉等；供试棉铃虫包含了对各类药剂及毒素敏感的敏感品系和各种类型的抗性品系等。

5. 研究计划与进展

2015年8月到10月间测定转Bt棉花材料对敏感棉铃虫的抗性情况

2015年10月到12月份间，测定转Bt棉花的毒素表达含量，并结合棉叶生测数据研究转Bt棉在其生长发育历期中表达毒素含量的变化与其抗虫性的关系