Xoc strain GD41 Tale基因的筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

过去20年的研究结果显示,水稻白叶枯菌（xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo）中的avr基因和决定其毒性变异的遗传学基础主要是arvbs3/ptha基因家族。由于该家族基因产物通过Ⅲ型分泌系统（t3ss）进入植物细胞核,起转录因子（transcriptionactivator-like，tal）作用，激活寄主的感病基因或抗性基因表达。tale是由一个中央dna结合区、一个核定位信号和两侧的n-末端的分泌信号及c-末端的转录激活域序列组成。其中的脱氧核糖核酸结合区域包括33-34个氨基酸的多个重复，每个重复中的12-13个氨基酸是高度变异的，两个氨基酸组成一个rvd(repeatvariabledi-residue),rvd组成、顺序决定与目标核苷酸序列的识别或结合。由于tale基因的高度同源，必须通过测序和序列分析才能明确细菌中tale的组成，进而研究tale基因的互作靶标。

已知xoo通过iii型分泌系统向寄主分泌转录激活因子tal,当效应因子激活寄主抗病基因表达时产生非亲和互作，当激活寄主感病基因表达时，产生毒性，促进病害发生。其中得到匹配鉴定的tal和抗病基因对子有avrxa27-xa27,avrxa10-xa10avrxa7-xa7。其他xoo中鉴定的tal基因靶标，如hen1等在病原-植物互作中也得到极大的关注。目前得到科学界最大的关注的是，tal基因识别的水稻感病基因在抗病育种中的作用。这类感病基因多数为水稻中的膜蛋白sweet，在运输光合作用产物中具有重要作用，与植物衰老、植物的抗逆反应及植物的生殖发育等许多方面起重要作用。xoo利用tal挟持寄主糖转运蛋白sweet基因的启动子，诱导sweet基因表达，促使水稻细胞中的蔗糖流入非原质体空间，细菌从而获得蔗糖养分，得以定殖和扩展。目前在水稻中已发现5个cladiiisweet组的ossweets与蔗糖运输有关，分别是ossweet11（xa13）、ossweet12、ossweet13（xa25）、ossweet14和ossweet15。xoo中已鉴定pthxo1特异性识别ossweet11（xa13），pthxo2识别ossweet13（xa25），而有多个菌株通过激活ossweet14的表达来促进病害发生。通过talen或crispr基因编辑技术修饰这些靶标基因的启动区被tale基因识别的区域结果导致抗病植株的产生。这进而促使科学家去利用xoo菌株中tale基因的组成和特异性识别来开拓新的抗病育种途径。即可以把多个菌株中的tale识别的核酸序列串联组成来驱动抗病执行基因如xa10，xa27记忆xa23等可以获得同时对白叶枯和细菌性条斑菌的广谱抗性。adam等通过大规模的基因组测序发现xoc菌株中可能存在5个保守的tal组成，这对通过上述途径培育抗细菌性条斑病菌水稻提供了捷径。

已知xoo和xoc两种细菌生物学和生理生化特性，致病因子及与植物互作的分子机制相似，但对水稻的侵入途径及侵入后的扩展行为完全不同，xoo主要从水孔侵入，而xoc主要从气孔侵入。另外在xoc菌株中有比xoo菌株中更多tal基因，但并没有发现xoc诱导任何sweet基因表达。那么xoc中tale基因的功能在病害发生中具有多大的贡献呢？

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：鉴定xocgd41tale基因组成

研究内容：

在已建立的xocgd41的基因组文库中，筛选出含有tale基因的所有阳性克隆。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1.pcr扩增技术

是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶dna特异地扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力，能检测单分子dna或对每10万个细胞中仅含1个靶dna分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于pcr具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。

4. 研究创新点

特色或创新之处

水稻白叶枯病菌（Xoo）里面的Tale基因部分功能已得到研究，其中部分基因决定细菌-水稻互作的亲和性，以及其他互作靶标。但水稻细菌性条斑病菌(Xoc)中Tale基因功能的研究还非常少。我们首先建立了XocGD41的基因组文库，在此基因库基础上筛选出含有Tale基因的所有阳性克隆，为进一步通过测序鉴定XocGD41基因组成及其靶标基因打下基础。

5. 研究计划与进展

研究计划：

1.利用1个月的时间，大量对xocgd41基因组文库进行初步阳性克隆筛选。筛选克隆近2000个。

2.利用4周时间对初步筛选出的阳性克隆提取质粒dna，并用bamhi进行酶切，电泳后，去除假阳性克隆及重复阳性克隆。