丁香假单胞菌大豆致病变种III型效应分子的克隆及功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大豆细菌性斑点病（bcaterialblightofsoybean）是造成大豆减产的主要原因之一，该病害是由革兰氏阴性植物病原菌丁香假单胞菌大豆致病变种（pseudomonassyringaepv.glycinea）引起的世界性病害。该病原细菌可借助iii型泌出系统将大量效应蛋白注射到寄主植物细胞抑制植物的防卫反应，包括：防卫基因的表达、植物抗菌抗生素的合成、植物细胞壁的增厚、抗菌代谢衍生物的渗出等[1-3]。大多数革兰氏阴性病原菌是通过iii型泌出系统将大量的效应蛋白注射到寄主细胞，抑制寄主植物的先天免疫反应和促进细菌的生长和扩散[4]。效应分子是革兰氏阴性植物病原菌及动物病原菌与寄主在互作中起关键作用的因子，这些效应分子包括无毒蛋白、dsp类蛋白和harpins，并且这些蛋白在病原菌致病过程中的作用不同。这些iii型效应因子通过三种主要方式来改变寄主植物的免疫应答。第一种是直接分裂寄主蛋白或靶标蛋白泛素化后通过26s蛋白酶体识别和降解；第二种是通过生物合成或rna结合蛋白的adp核糖化来改变rna代谢；第三种是通过去磷酸化或直接抑制对植物防卫信号转导中激酶活性。

自从第一个无毒基因从pseudomonassyringaepv.glycinea克隆得到后，目前已经从各种植物病原菌中鉴定出几百个iii型效应分子，但仅有少量的效应蛋白进行了功能鉴定。迄今为止，已发现的效应蛋白主要有半胱氨酸蛋白酶活性、络氨酸磷酸酶[5]、丝氨酸/苏氨酸激酶[6]和e3泛素连接酶活性[7]，然而，大多数植物病原iii型效应分子先天免疫抑制活性还不清楚。丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)是一种能够侵害植物枝、叶、花、果等组织的植物病原菌，根据寄主范围的不同至少可以分成50个致病变种。目前在模式菌株pseudomonassyringaepv.tomatodc3000中，有多于30个效应蛋白被鉴定，随着对已经全基因组测序的四个丁香假单胞致病变种(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000，pseudomonassyringaepv.tomatot1，pseudomonassyringaepv.syringaeb728a，pseudomonassyringaepv.phaseolicola1448a)全基因组分析发现，每个致病变种中均存在多个效应分子，这些效应分子有的保守性较高，同时存在于不同的致病变种中，有的仅存于个别致病变种中，这为研究效应分子的进化机制及致病机理提供了基础[8]。

由丁香假单胞大豆致病变种（pseudomonassyringaepv.glycinea)引起的大豆细菌性斑点病是大豆生产上最普遍的细菌性病害，也是造成大豆减产的主要原因。目前，对大豆细菌性斑点病的研究主要集中在病原菌及抗病品种的鉴定等方面，而对效应分子的研究及致病分子机制还知之甚少。综上所述，研究丁香假单胞菌大豆致病变种iii型效应分子具有非常重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

工作假说：

效应分子致病机理研究：根据丁香假单胞菌大豆致病变种a1菌株全基因组测序结果分析，利用常规pcr技术，从丁香假单胞菌大豆致病变种全基因组中克隆得到功能未知的效应分子。通过生物信息学分析预测效应分子的二级结构和信号肽。利用荧光标记表达载体，通过农杆菌介导的瞬时侵染技术检测所得效应分子的作用，为进一步的发掘更多的具有类似功能的效应分子及通过定点突变技术研究效应分子在病原菌侵染大豆中的作用提供理论基础。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究材料：

从本实验室保存的丁香假单胞大豆致病变种（pseudomonassyringaepv.glycinea）a1菌株。

4. 研究创新点

目前，对大豆细菌性斑点病的研究主要集中在病原菌及抗病品种的鉴定等方面，而对效应分子的研究及致病分子机制研究甚少。并且以往大多是通过突变体在其体内进行研究。而本实验通过体外克隆，利用农杆菌瞬时表达技术来研究效应分子对植物免疫系统的影响。

5. 研究计划与进展

计划：

（1）2015年07月至2014年8月：预测所用菌株中iii型效应分子的种类，并采用常规pcr技术克隆到3个效应基因。

（2）2014年8月到2015年10月：完成农杆菌介导的瞬时表达载体的构建