转CP基因大豆植株抗大豆花叶病毒病的鉴定与筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1国内外研究概况及应用前景

大豆[glycinemax(l.)merr.]是世界上重要的油料作物和高蛋白质含量的粮饲兼用作物，含有大量人体所需的蛋白质、脂肪及异黄酮等多种对人体有益的活性物质。随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，世界各国对大豆的需求量越来越大。然而，由于人口的增长、耕地面积的减少，加之传统育种方法育种年限长，难以短期内获得高产综合性状优良大豆品种，很难满足人们需求。转基因技术的出现，打破了常规育种的各种局限，缩短了育种年限，开辟了分子育种的新局面，使得培育具有高产、抗病、抗逆境及抗胁迫等多种性状的大豆新品种成为了可能。1988年，世界上第一例转基因大豆诞生于实验室(mccabeetal[1].,1998;hincheeetal[2].,1988)，开启了转基因大豆新品种创制的先河。1994年，世界上首个批准商业化的转基因大豆-美国孟山都公司研制出的抗草甘磷除草剂转基因大豆问世，引发了世界大豆产业的变革；1997年，杜邦公司培育出的高油酸转基因大豆获得美国政府部口批准，其油酸含量比普通大豆高出约70%；1998年，agrevo公司推出的抗草铵磷转基因大豆获得商业化种植批准(余永亮[3]等，2010)。转基因大豆的商业化进程，推动了大豆产业的快速发展。

转基因大豆是众多转基因作物中种植区域最广、种植面积最大的作物。自1996年第一例转基因大豆批准进行商业化种植以来，生产面积呈现逐年快速增长的趋势。在1999年后更是占到全球转基因作物种植面积的一半以上。2004年，全球转基因大豆的种植面积达到4840万公顷，约占全球大豆种植面积的60%，占全球转基因作物种植面积的53%。在大豆生产中，转基因品种的种植比例达到70%。2008年，全球转基因大豆的种植面积约为6580万公顷，约占全球转基因作物总种植面积的52.6%，占全球大豆总种植面积的67.2%。2014年，全世界商业化种植的转基因大豆面积超过9000万公顷，约为世界大豆总收获面积的82%(james[4]，2014)。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标和内容

本研究是在前人研究的基础上进行。翟锐选用华春6号为受体材料，借助转基因手段将SMV自身CP基因部分保守片段的反向重复序列（Invertedrepeatsequences，IRs）导入大豆中，利用RNA干扰（RNAinterference，RNAi）机制引发RNA沉默（RNAsilencing），即序列特异性的转录后基因沉默（Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS），从而诱发RNA介导的抗性（RNA-mediatedresistance），即源于病原诱导的抗性（Pathogen-derivedresistance，PDR），最终得到对SMV具有广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。利用已优化的农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，对受体材料进行转基因实验（携带抗草丁膦除草剂），通过鉴定共得到4个转基因T2代家系。

本研究在翟锐研究的基础上对基于外源基因CP的T2代转基因材料进行鉴定、筛选，选育高抗的转基因品系材料，旨在对转基因抗病育种技术提供一定的借鉴。

2.2研究材料

T2代转基因材料：从4个家系中挑选13个单株为研究对象（表2-1）。

表2-1转外源基因CP的转基因材料情况表

2.3拟解决关键问题

1、播种前繁毒：包括4种大豆花叶病毒株系：SC3、SC7、SC15和SC18；

2、接毒：4个T2代家系中挑选13个单株后代接种4种大豆花叶病毒株系（以家系为单位接种，涵盖四种病毒株系）。

3、阳性转基因大豆植株的鉴定：（1）除草剂涂抹；（2）PCR检测；（3）Bar试纸条。

4、转基因植株V1-V4期和倒三叶期发病情况调查。

5、转基因材料DAS-ELISA病毒含量测定。

3. 研究的方法与方案

3.1方法和手段

3.2.1汁液摩擦接种法繁殖、活化smv

在防虫温、网室中播种感病大豆品种南农1138-2的种子于沙土盆中，直至第一对真叶完全展开。将保存于液氮中的smv株系取出并放置于冷却的经过高温灭菌的洁净研钵中，加入适量的smv接种液（0.01m磷酸缓冲液，约每1g叶片组织加入3-5ml缓冲液）以及少量的金刚砂（约600目），并在研钵中碾磨成匀浆。然后用经过紫外线灭菌的毛刷将匀浆涂抹至第一对展平的真叶上。防虫温、网室内定期喷施药剂（吡蚜酮）杀灭蚜虫，以防蚜虫传毒造成株系交叉侵染。实验中所用的研钵、研棒以及毛刷均提前用洗洁精清洗干净，研钵、研棒在微波炉中高温杀菌10min，毛刷放置在消毒柜中紫外线杀菌30min。接种smv时，必须佩戴一次性塑料手套；繁殖、活化不同smv株系时，须更换新手套。

4. 研究创新点

本实验采用除草剂涂抹、PCR和PAT/bar转基因检测试纸三种手段，对试验材料进行严格地鉴定，并且三种检测方法均为阳性的幼苗才被认定为阳性转基因大豆植株，在此基础上对外源基因CP的T2代转基因材料进行筛选，选育高抗的转基因品系材料。

5. 研究计划与进展

1）繁毒及播种2)第一真叶展平时除草剂涂抹接毒3)pcr检测、bar转基因检测试纸4)调查植株第1对至第4对复叶（v1-v4）的smv发病症状

5）花期倒三叶的smv发病等级调查

6）对转基因材料部分家系植株进行das-elisa（接种病毒3周后一次，5周后一次，观察病毒蛋白水平变化趋势）；两次进行实验的材料保持一致。