Zebularine诱发小麦异染色体系染色体变异体的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

染色体工程是按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术，是转移和利用外源基因的重要途径，其中如何高效方便地诱发染色体变异是植物染色体工程的重要方向。目前诱发染色体变异的因素包括物理因素、化学因素和生物因素等，其中化学诱变在诱发基因突变的实践中具有操作简单、经济有效的特点，得到了大量应用，但在诱导植物染色体变异方面应用较少。

dna甲基转移酶抑制剂（zebularine）是一种胞苷类似物，具有半衰期长、稳定性好的特点^[1]。与同类药物的氮杂胞苷和-杂氮-2-脱氧胞苷相比较，zebularine在抗肿瘤方面表现出了显著的优势，如zebularine具有低毒性和与对肿瘤细胞高度选择性，因此对该药的深入研究具有更好的临床意义^[2]。张征^[3]等发现zebularine具有有效抑制sgc-7901细胞株的增殖和迁移并提高抑癌基因p16 mrna的表达的效应。丁佑铭^[4]发现zebularine能抑制hepg2细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与上调runx3表达，进而增加细胞case-pase一3、casepase一9活性，下调bcl一2基因的表达及上调bax基因有关；沈文静^[5]发现zebularine能使女性卵巢癌细胞rassfia基因去甲基化状态，从而调控rassfia基因重新表达。另外，苏文龙等^[6]发现，采用zebularine处理绵羊卵丘细胞可显著提高绵羊体细胞核移植胚胎的胚胎发育率，处理浓度以5 nmol/l效果最佳。

但是zebularine在诱发植物染色体变异研究上仅有较少的进展。baubec等^[7]首先将zebularine应用到植物研究中，发现zebularine能降低拟南芥全基因组甲基化水平，抑制拟南芥的生长，且抑制生长和降低甲基化水平的能力随着zebularine处理浓度的增大而增加；另一方面，zebularine可以显著降低特殊序列甲基化水平，重新活化沉默的基因。从而为研究和利用zebularine开辟了新的方向。2011年，choet al.^[8]研究表明，zebularine对小麦根的伸长抑制效果与浓度和处理时间有关，有丝分裂指数随着处理时间和浓度的增加而降低。另一方面在zebularine处理的根尖细胞中发现多种染色体结构变异，细胞中的染色体结构异常的频率与zebularine处理剂量大致成正比例。ma et al.^[9]通过大量试验，成功建立了利用zebularine高效诱致可稳定遗传的染色体变异的新方法，研究发现zebularine可以诱发产生丰富的变异类型，其中小片段和中间插入易位可能具有育种应用潜力，zebularine诱发产生的一些染色体变异体具有传递给子代的能力。但是，对于这种试剂能否应用到更多的小麦异染色体系及其他植物中尚需要继续的试验验证。本研究即在前人研究基础上，将zebularine诱导染色体变异推广到其他小麦异染色体系如小麦-黑麦2r或小麦-百萨偃麦草4j附加/代换系等，继续探讨不同的浓度、温度和处理时间以及不同的组织器官的诱变效应，进一步优化这种诱变方法，以期实现高效诱导特定染色体变异。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：明确zebularine在诱导其他小麦异染色体系外源染色体变异的效应。

研究内容：探究zebularine在诱导特定染色体变异中的效应；利用细胞学鉴定和形态学观察并计算种子发芽率与细胞突变频率，观察根尖细胞染色体，总结zebularine在小麦特定染色体体变异中所起到的作用。

拟解决的关键问题：

3. 研究的方法与方案

研究方法:细胞学鉴定和形态学观察

技术路线：前期知识与操作技术储备--实验前的材料仪器准备--预实验--选取生活力和体积一致的小麦种子--采取化学诱导方法将小麦种子诱导其染色体变异--选取10-15粒小麦放入培养皿进行发芽与发根实验，重复两到三次--设置对照--计算发芽率剪根--笑气处理--敲根，保存，去盖玻片，脱水--碱变性，洗片，原位杂交，洗片，制片--在荧光显微镜观察，计算细胞变异频率，观察2r,4j染色体变异情况--将材料种在试验田，收种子--重复上述部分步骤--结果处理与分析

实验方案：

4. 研究创新点

利用zebularine诱导小麦异染色体系中外源染色体2R或4J变异体的方法，探讨zebularine诱发特定染色体变异的效应。

5. 研究计划与进展

研究计划：7.7-7.31：学习理论知识，查阅部分文献。

8.20-10.10：开始接触一部分简单的操作，在熟练掌握的基础上接触部分 较复杂的实验步骤，准备考研。

10.11-12.25：正式进入考研阶段，完成复习计划。期间帮助师兄做部分实验，完成毕业实习文献综述。