1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,gfp)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时, gfp发射绿色荧光。近年来,随着gfp在各种异源细胞,如细菌、昆虫及植物细胞中的表达, gfp作为一种新型的报告物在生物学界引起了广泛的关注,关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造均有大量的研究报道。它是一种操作方便,不用加外源底物,就能在活细胞中检测的分子探针。将彻底改观过去标记方面的研究方法,在分子生物学研究中有着重要意义和广阔的应用前景。
1.绿色荧光蛋白的研究进展
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：探索egfp在大肠杆菌中的最适表达环境以得到荧光性能更好的荧光蛋白
内容：将 egfp 的 cdna 序列构建到大肠杆菌中表达，并且进行蛋白的纯化。培养过程中对各种条件( 培养温度、培养时间、接种方式) 的控制，利用电泳检测，测定egfp在大肠杆菌中的表达量，通过比较得到egfp在大肠杆菌中表达的的最优条件。
egfp在不同温度、不同接种方式以及不同诱导时间情况下，蛋白的表达效果有差异。诱导培养温度不仅影响菌体的生长，还影响重组质粒的稳定性，融合蛋白表达量、可溶性和稳定性。故设置了24℃和37℃这两个温度进行比较实验。对于接种方式来说,接种方式影响大肠杆菌的生长，进而影响荧光蛋白的表达。对于培养时间来说，时间过短不利于蛋白的充分表达，时间过长可能产生一些酶和部分毒蛋白，使蛋白降解。故选择培养时间为11h。
3. 研究的方法与方案
研究方法:
一、两个温度 三个接种方式
每个处理接种3支5ml试管。
常规的诱导表达方法（KRX细胞和pRSET载体手册）：
接种单菌落于5ml LB Amp 50mg/L、37℃275rpm摇培养过夜。
1:20(1.5ml，或150μL2)接种到新鲜30ml LB Amp 50mg/L、37℃（估计约0.5小时，培养15分钟后监测OD600，每10分钟测一次）和24℃培养（需更长时间小时，培养1.5个小时后开始监测，根据情况约每20-30分钟监测OD600一次）至OD600=0.4-0.5。
取其中的5ml加鼠李糖0.025ml至终浓度0.1% (1:200 dilution of 20% rhamnose)诱导表达。
1. 试验培养方法1，常规方法：
接种单菌落于LB Amp 50mg/L、37℃275rpm摇培养过夜。
1:20稀释新鲜LB Amp 50mg/L、分别在37℃和24℃275rpm摇荡培养至OD600=0.4-0.5，然后进行诱导表达培养：5ml加0.025ml 20%鼠李糖母液。
2. 试验培养方法2：
接种单菌落于LB Amp 50mg/L、37℃275rpm摇培养过夜。
接种一接种环的菌液于新鲜LB Amp 50mg/L、分别在37℃和24℃275rpm摇诱导培养：5ml加鼠李糖0.025ml。
3. 试验方法3：
从培养皿上接种一单菌落于新鲜LB Amp 50mg/L、分别在37℃和24℃275rpm摇诱导培养：5ml加鼠李糖0.025ml。
二、诱导培养后跟踪生长和表达情况：
在现在的气温下这是一个问题：隔一定时间取出培养物后它会继续生长。
同时测定OD600和荧光强度。以确定表达培养的平台期时间。
诱导培养见悬浮物混浊后进行监测：37℃下培养的在诱导培养后可能可在2个小时开始，每0.5个小时测OD600和进行荧光扫描与测定；24℃下培养的在诱导培养后可能可在5个小时开始，每45-60分钟测定一次。扫描步长皆1，闪光数10。
质粒 | 激发波扫描波长范围（nm） | 发射波扫描波长范围（nm） | 荧光测定波长（nm） |
pEG1 | 455-510,发射波长544nm 增溢70 | 激发波长460nm ,495-539 增溢70 | 481,513 增溢60 |
pBMR | 536-578,发射波长610nm 增溢80？如果溢出改为70 | 激发波长535nm 569-643 增溢80？ | 560,596 增溢80 |
进入平台期（荧光强度和OD600都不增长）时停止培养，离心收集细胞。-20或-80℃保存或提取蛋白质。
三、表达蛋白质纯化和蛋白质的测定
表达培养进入平台期后取适当细胞进行总蛋白质SDS-PAGE电泳和纯化蛋白质SDS-PAGE电泳。
用试剂盒 (Bradford或BCA方法) 和SDS-PAGE电泳密度计量测定蛋白质含量
可行性分析：本实验有很强的研究基础，国内外很多科学家都研究过。当地实验室及实验环境也毕竟适合做这个实验。
4. 研究创新点
本实验的创新之处在于对实验方法的创新，进行了针对接种方式对EGFP在大肠杆菌中表达的荧光性能的研究，这在之前是很少见的
5. 研究计划与进展
2016.07~2016.09 进行预实验，初步的了解egfp在大肠杆菌中荧光性能表达的大致适宜温度及培养时间。
2016.09~2017.02 进行正式实验以及重复实验，探究egfp在大肠杆菌中荧光性能表达的最适环境。
2017.02~2017.03 进行分析整理，得出初步结论
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