利用黑腹果蝇探究P450基因在褐飞虱对噻嗪酮抗性中的作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

褐飞虱nilaparvata lugens（stal)属于半翅目飞虱科，是我国与东南亚许多水稻生产国重要的迁飞性害虫，具有虫体小、善迁飞、繁殖力强、危害烈、易变异等特点，主要通过直接刺吸、产卵危害以及作为媒介传播水稻病毒病等方式危害水稻^[1,2]。褐飞虱在我国的发生和危害十分频繁和严重，由于我国面临的严重人口压力及其它防治方法的滞后性等缺点，化学防治在很长时间内是防治褐飞虱的主要途径^[1]。然而长期以来化学药剂的大量连续使用，及操作的不规范性，造成了褐飞虱对常用杀虫剂已经普遍产生了不同程度的抗药性^[3]，而我们对杀虫剂抗性机理的研究则有助于制定科学有效的害虫管理策略，也能为新药的研发提供新思路。

噻嗪酮(buprofezin,商品名扑虱灵)是由日本农药株式会社于1997年开发的一种抑制昆虫表皮几丁质合成的生长调节剂(igrs)，会导致昆虫在蜕皮过程中死亡，但对成虫无直接致死作用。噻嗪酮于80年代后引进我国用于稻飞虱的防治，由于噻嗪酮不仅对褐飞虱低龄若虫具有很高的毒性，而且具有对人畜低毒、对褐飞虱天敌安全以及与环境相容性好的等特点，因此，在90年代初期很快在国内推广开来，并迅速取代了当时常规的一些杀虫剂而成为了防治褐飞虱的首选药剂。据研究表明， 1996到2004年间褐飞虱对噻嗪酮为敏感-敏感性下降阶段，未产生抗性^[4]，但2008年已有田间种群表现出中等水平抗性^[5]，2010年所有监测种群均对噻嗪酮产生了中等水平抗性^[6]，而到2013年我国褐飞虱种群对噻嗪酮已经普遍达到了高水平抗性^[7]（100.8-711.0倍），根据我们的监测数据全国农业技术推广服务中心于2014年2月发文建议暂停噻嗪酮在褐飞虱防治上的应用^[8]。然而，对于褐飞虱为何对噻嗪酮产生如此高水平的抗药性，其抗药性机制为何，一直未知。

细胞色素p450(简称p450)是1958年由garfinkel和klingenberg在哺乳动物的肝脏微粒体中发现的一类以还原态与co结合后在波长450 nm 处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质^[9]。细胞色素p450分布非常广泛，原生生物、植物、真菌、动物和人体内都有它的分布，并由于他们的遗传多样性、广泛的底物特异性和催化活性，p450和p450氧化还原酶构成了唯一能够解毒各类杀虫剂的代谢系统^[10]。zhu等用药物代谢实验和转基因果蝇实验证明，在赤拟谷盗脑部特异性过量表达cyp6bq9可以代谢溴氰菊酯^[11]。ding等用离体代谢和rnai实验证明，褐飞虱cyp6ay1的上调表达使其对新烟碱类杀虫剂吡虫啉产生抗性^[12]；zhang等研究表明褐飞虱cyp6ay1,cyp6er1,cyp4ce1,cyp6cw1均能代谢吡虫啉^[13]。bogwitz等对抗昆虫生长调节剂虱螨脲的果蝇品系进行研究，发现cyp12a4过量表达，利用gal4/uas基因表达系统证明cyp12a4的过量表达与其对虱螨脲的抗性有关^[14]。nauen通过代谢实验证明烟粉虱cyp6cm1可以羟基化吡蚜酮^[15]。p450对杀虫剂的代谢作用会直接影响到昆虫对杀虫剂的耐受性和杀虫剂对昆虫的选择性，由p450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是导致昆虫产生抗药性的常见而重要的机制。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标

在实验室前期的研究中，我们得知了褐飞虱对噻嗪酮日益增长的抗性受到了褐飞虱体内的p450基因（cyp6er1, cyp6cs1, cyp439a1）的调控，实验室前期通过将cyp6er1, cyp6cs1, cyp439a1三个p450基因单独转入果蝇体内驱动表达后，对转基因果蝇进行生物测定，分析其致死率来探究着三个基因对噻嗪酮抗药性的影响，但其并未表现出明显的抗药性。在此前提下，我们决定继续深入研究这三个基因的互作作用，明确是否基因两两配对后会产生明显的增效协助效应，是否两个基因同时表达后会对噻嗪酮产生显著的抗药性，进一步探明褐飞虱体内的p450基因在噻嗪酮抗药性中的作用机理。

2.研究的内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

此次课题的研究对象为黑腹果蝇，利用转单个褐飞虱p450基因黑腹果蝇间的杂交，培养挑选出带有两个p450基因（cyp6er1-cyp6cs1,cyp6er1-cyp439a1）的黑腹果蝇品系，通过给其f1代一龄幼虫饲喂拌有不同浓度的果蝇饲料进行生测实验，收集其致死率，进行数据分析后印证本课题提出的猜想。

2.技术路线与实验方案

4. 研究创新点

根据查阅文献及实验室前人所作出的研究，不难发现过往的研究多是利用果蝇去研究单个P450基因的功能，此外实验室之前的研究也发现存在多个P450的过表达，但只是研究了单一基因的功能。因此，我们的创新之处在于，1.探究了两个P450基因在参与褐飞虱对噻嗪酮的抗性中的协同作用；2.在已有基础上进一步揭露P450基因在褐飞虱对噻嗪酮的抗性机制中所发挥的效应。所以此次课题角度更为独特，研究也更加新颖全面。

5. 研究计划与进展

1.研究计划

2018.5-2018.6 与导师讨论确定课题大致内容，阅读相关文献，掌握一定理论知识；

2018.7-2018.8 学习如何制作果蝇饲料与饲养果蝇，学习果蝇品系的构建；