1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
植物病害是农作物减产的主要原因。作为世界人口持续增长的国家，提高农作物产量很重要。
番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，tswv）于 1915 年在澳大利亚被首次报道，现已蔓延至世界各地，自 1989 年在广州出现以来，已在云南、贵州、四川、广东、广西、山东、河南、河北、北京、天津、陕西、宁夏等番茄主产区大面积发生，成为继番茄黄化曲叶病毒病之后的又一种重要病害。
tswv 可以侵染 900 多种植物（包括农作物与杂草），如大豆、莴苣、花生、辣椒、马铃薯、烟草、番茄、芹菜、南瓜和桔梗等。tswv 可以引起植株坏死、黄萎以及叶片、茎部、果实出现斑点等症状,对寄主产量造成严重损失[1]。植物化学防治疾病对环境造成重大影响，植物天然的抗病基因能成为更好的解决方案。改良植物遗传控制研究植物的抗病基因的结构与功能对我们改良作物品种，摒除转基因产品具有重大意义；并且这种天然免疫能够减少化学产品的应用，减少环境污染，提高人们的生活质量。
2. 研究的基本内容和问题
| 本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 1.1项目来源，研究意义 植物病害是农作物减产的主要原因。作为世界人口持续增长的国家，提高农作物产量很重要。 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）于 1915 年在澳大利亚被首次报道，现已蔓延至世界各地，自 1989 年在广州出现以来，已在云南、贵州、四川、广东、广西、山东、河南、河北、北京、天津、陕西、宁夏等番茄主产区大面积发生，成为继番茄黄化曲叶病毒病之后的又一种重要病害。 TSWV 可以侵染 900 多种植物（包括农作物与杂草），如大豆、莴苣、花生、辣椒、马铃薯、烟草、番茄、芹菜、南瓜和桔梗等。TSWV 可以引起植株坏死、黄萎以及叶片、茎部、果实出现斑点等症状,对寄主产量造成严重损失[1]。植物化学防治疾病对环境造成重大影响，植物天然的抗病基因能成为更好的解决方案。改良植物遗传控制研究植物的抗病基因的结构与功能对我们改良作物品种，摒除转基因产品具有重大意义；并且这种天然免疫能够减少化学产品的应用，减少环境污染，提高人们的生活质量。 1.2 国内外研究现状、水平 番茄斑萎病 番茄斑萎病是一类分布广泛,在许多植物上引起严重症状的病害,由布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)典型成员番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)系统侵染引起。 TSWV 可以通过机械传播，但不能通过种子传播。TSWV 可以在蓟马体内复制因此蓟马成为 TSWV 主要的传播载体。蓟马的种类超过 5 000 种，但是已知的传播 TSWV的蓟马种类仅 9 种。 TSWV 病害流行主要有 3 方面因素：（1）感病作物重茬；（2）杂草寄主的流行；（3）蓟马的泛滥。蓟马获毒后，病毒首先进入其中肠，随后到达唾腺。由于蓟马幼虫阶段中肠和唾腺非常接近， 番茄斑尾病毒（Tswv）有以下几种防治方法 栽培管理：在栽培过程中发现 TSWV 需立即清除，以免病毒进一步扩散。要特别注意清除田间杂草，因为很多杂草也是 TSWV 的寄主。 生物或化学药剂：通过喷施化学药剂（如甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、白僵菌生物菌剂、阿维菌素等）防治西花蓟马以及其他传播介体，以控制 TSWV 的传播与蔓延。 选择抗性品种：在花生、辣椒、番茄中已经培育出既抗 TSWV 又有较好农艺性状的新品种[2]。 番茄斑尾病毒（Tswv）及番茄抗性蛋白（Sw-5b) 番茄斑萎病毒属病毒是一类对农业生产造成严重危害的植物多分体负义链RNA病毒,而Sw-5b是番茄上进化出的一个针对番茄斑萎病毒属病毒具有广谱抗性的免疫受体蛋白[3]。近年来的研究表明免疫受体蛋白的亚细胞定位在抗病信号通路中发挥着重要作用,番茄Sw-5b是一个含有额外的N端结构域(NTD)的CC-NB-LRR类型的免疫受体蛋白。Ｓｗ－5ｂ全长包括１，２４６个氨基酸（Ｂｒｏｍｍｏｎｓｃｈｅｎｋｅｌｅｔａｌ．２０００；Ｓｐａｓｓｏｖａｅｔａｌ．２００１），蛋白分子量为１４０kDa。与其他Ｒ蛋白一样（Ｍｏｆｆｅｔｔｅｔａｌ．，２００２；Ｒａｉｒｄａｎ＆Ｍｏｆｆｅｔｔ，２００６；Ｒａｉｒｄａｎｅｔａｌ．，２００８；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１５），Ｓｗ－５ｂ具有模块化的结构。Sw-5b的氨基酸序列和结构域图中左边显示Sw-5b包含ＮＴＤ（额外的Ｎ端结构域），=ＣＣ（卷曲螺旋）、ＮＢ（核苷酸结合）、ＡＲＣ１（在人凋亡蛋白酶激活因子Ａｐａｆ－１，植物Ｒ蛋白和秀丽线虫ＣＥＤ４４５。番茄抗病蛋白Ｓｗ－５ｂ自抑制与激活的调控机理及亚细胞定位研究中是保守的）、ＡＲＣ２和ＬＲＲ（富含亮氨酸重复）结构域[4]。 已有实验结果表明ＮＢ－ＬＲＲ具有特异性诱导依赖于ＮＳｍ的细胞死亡的能力。随后实验又用一些能够自激活的突变体这去测试ＣＣ的抑制作用，把每一个突变体单独引入到ＣＣ－ＮＢ－ＬＲＲ中。在此研究中，因为生物表型有时候受多种因素影响，所以一般死亡表型的测定至少重复
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| 三次，每次三个重复。结果显示不存在ＮＳｍ时，与ＮＢ－ＬＲＲ突变体诱导很强的细胞死亡相比，相对应的ＣＣ－ＮＢ－ＬＲＲ突变体产生很弱或者没有死亡表型。结果表明ＣＣ的存在抑制了ＮＢ－ＬＲＲ突变体的自激活活性[4]。
mediator complex （中介体复合物） 真核细胞的转录调控是一个复杂的过程。与原核生物相比，真核细胞基因组庞大，染色质结构复杂，调控元件众多。中介体复合物(mediator complex)是一类广泛存在于真核细胞内的基因表达调节蛋白，通过与RNA聚合酶II(polymerase II，pol II)以及通用转录因子(general transcription factors，GTFs)相结合发挥桥梁作用，最终调节基因的转录过程。 中介体复合物最早在酿酒酵母中发现，当时研究人员观察到，单纯在体外转录系统内增加pol II及GTFs含量，并不能完成转录过程，而在酵母的提取物中发现了一种转录依赖的活性物质，即中介体复合物。酿酒酵母的中介体复合物由25个亚基构成，大小约1.4 MDa，根据其结构和功能，中介体复合物分为头部、中部和尾部以及细胞周期素依赖性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)亚模块，其中头部模块包括：Med6，Med8，Med11，Med17/Srb4，Med18/Srb5，Med19/Rox3，Med20/Srb2和Med22/Srb6；中部模块包括：Med1，Med4，Med5/Nut1，Med7，Med9，Med10/Nut2，Med21/Srb7和Med31/Soh1；尾部模块包括 Med2，Med3/Hrs1， Med14/Rgr1，Med15/Gal11和Med16/Sin4。 中介体复合物可与大部分GTFs协同作用，作为一个模块化并动态变化的多蛋白复合物，中介体在连接转录基因和转录复合物之间发挥着信号感受器、整合器及处理器的功能。在中介体复合物的众多功能中，最常见的是对编码基因的转录过程进行操纵，中介体复合物发挥基因表达调控作用主要通过物理接触以及激酶活性[5]。
参考文献： [1]陈小姣. 番茄抗病蛋白Sw-5b自抑制与激活的调控机理及亚细胞定位研究[D].南京农业大学,2016. [2]李云洲,默宁,闫见敏,曹贺贺,庞胜群,梁燕.番茄斑萎病毒病研究进展[J].园艺学报,2018,45(09):1750-1760. [3]陈小姣. 番茄免疫蛋白受体Sw-5b的亚细胞定位与抗性功能研究[A]. 中国植物病理学会.中国植物病理学会2016年学术年会论文集[C].中国植物病理学会:中国植物病理学会,2016:1. [4]白保辉. 抗性蛋白Sw-5b与番茄斑萎病毒无毒因子NSm识别位点的鉴定[D].南京农业大学,2016. [5]杨明磊,钟南哲,李一明,李维卿.中介体复合物在真核细胞转录调控中的研究进展[J].临床与病理杂志,2017,37(05):1073-1079.
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3. 研究的方法与方案
研究方法：
1.构建实验所需的各个载体。
2.利用酵母双杂交、bifc、co-ip技术验证sw5b的cc区域与转录中介体mediator之间的互作。
4. 研究创新点
前人在对于抗性基因的研究过程中，并未有人发现抗性基因本身可以作为一个转录因子募集mediator，从而启动下游的抗病响应基因的表达。
已经有人报道某些抗性基因的nb区域可以与dna结合，作为一个dna binding domain，如果我们的猜想是正确的，即sw5b的cc区域具有转录激活活性，可以行使activation domain的功能，那么，sw5b将会是第一个被发现具有转录因子功能的抗性基因。
5. 研究计划与进展
2018．10-2018.11 载体构建
2018.12-2019.2 cc区域与转录中介体mediator之间的互作的鉴定
2019.2-2019．04 cc的转录激活活性的验证
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